Effekt af ikke-kirurgisk periodontal behandling på immunsystemet fra et kønsperspektiv

Blod, tandkøds-crevikulær væske (GCF) og spytprøver vil blive indsamlet fra patienter ved baseline og 12 uger efter ikke-kirurgisk parodontal behandling. Fra fastende blodprøver (12 timer), vil perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) og neutrofile fraktioner blive isoleret ved hjælp af en immunomagnetisk metode, ifølge producentens protokol, og plasma og serum vil blive opbevaret ved -80°C indtil analyse. LUNA-FL vil blive brugt til at bestemme celletal og levedygtighed (acridinorange og propidiumiodid dobbeltfarvning) i celleprøver. GCF-prøver vil blive opsamlet i to eksemplarer ved forsigtigt at indsætte sterile papirpunkter i parodontallommen 1 mm i 30 s. Volumen vil blive bestemt ved hjælp af Periotron 8000 og opbevaret ved -80°C til fremtidige bestemmelser. Ustimuleret spyt vil blive opsamlet i RNase-frie rør ved ekspektorering, og efter centrifugering vil supernatanten blive opbevaret ved -80°C til mikroRNA (miRNA) analyse.

Kliniske parodontale parametre for sonderingslommers dybde (PD), millimeter af klinisk tilknytningsniveau (CAL), blødning ved sondering (BOP), forenklet plakindeks for Silness og Löe og forenklet kalkindeks for Greene og Vermillion vil blive bestemt ved hjælp af en konventionel manual parodontal probe (UNC-15 PCP). En parodontal undersøgelse vil blive udført for at måle PD, CAL og BOP på seks steder pr. tand for alle tænder, eksklusive tredje kindtænder, som tidligere beskrevet. Patienterne vil blive interviewet om deres sygehistorie, livsstilsvaner (rygning, hyppighed af tandbørstning, fysisk aktivitet) og sociodemografiske karakteristika. Vægt, højde og blodtryk vil blive målt ved hjælp af standardiserede metoder. Biokemiske parametre for kulhydratmetabolisme - glucose, insulin, glykeret hæmoglobin (A1c) -, lipidprofil - total kolesterol, LDL, HDL, triglycerider (TG), apolipoproteiner AI og B -, nye inflammatoriske og kardiovaskulære risikomarkører - C-reaktivt protein ( CRP), C3c og retinolbindende protein 4 (RBP4) - og fuldstændig blodtælling vil blive bestemt på hospitalets Klinisk Analyseservice.

Til påvisning af forskelle i proteinekspression vil celler blive inkuberet i lysisbuffer med protease- og fosfatasehæmmere (RIPA-buffer) i 15 minutter ved 4 grader celsius (°C). Supernatanten vil blive opsamlet efter centrifugering i 15 minutter ved 16.000 g. Den samlede proteinkoncentration vil blive kvantificeret ved hjælp af en bicinchoninsyre (BCA) proteinanalyse. Alikvoter på 25 µg protein vil blive opløst på 8-16% gradient SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner. Målproteiner vil blive påvist ved at inkubere membranerne med anti-aktin, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspase 1, NADPH oxidase, katalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alpha, mTFA, VDAC, Complex I, II, III, IV og V. Proteinsignalet vil blive detekteret ved kemiluminescens og analyseret ved densitometri.

Inflammasomkomplekssamling (første fase af aktivering) gennem co-lokaliseringsundersøgelser af NLRP3-ASC i PBMC'er vil blive udført ved hjælp af konfokal- og/eller fluorescensmikroskopi. Kort fortalt vil PBMC'er blive udsået på dækglas coatet med Poly-D-Lysine, fikseret med paraformaldehyd (PFA) 4% i 20 minutter, permeabiliseret med Triton X-100 i 20 minutter og blokeret med fosfatbuffer saltvandsbuffer-bovint serumalbumn ( PBS-BSA) 3 % i 1 time ved stuetemperatur. Hybridisering med specifikke primære antistoffer (fortyndet i PBS-BSA 1%) vil blive udført natten over ved 4 ºC, og derefter vil sekundære antistoffer konjugeret med AlexaFluor fluoroforer blive inkuberet i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Farvede prøver overføres dækglasset til et objektglas og konserveres i anti-fade fluorescens monteringsmedium.

Cirkulerende niveauer af cytokiner, adhæsionsmolekyler og serumoxidative stressmarkører vil blive målt i serumprøver, men til sekretomundersøgelser vil 1x10^6 PBMC'er tidligere blive inkuberet i 1 ml RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 4 timer (37°) C, 5 % CO2) for at opnå supernatanten. Både serum og supernatanter vil blive analyseret med et Luminex® 200 analysatorsystem efter Milliplex® MAP Kit-producentens procedure. De samme bestemmelser vil blive udført på GCF og serum/plasmaprøver fra patienter.

Kvantificeringen af ​​funktionelle autophagosomer i PBMC'er vil blive udført ved hjælp af flowcytometri på vores BD Accuri-udstyr med CYTO-ID® Autophagy-detektionskit efter producentens procedure. Parallelt hermed vil leukocytter fra fuldblodsprøver blive inkuberet med redoxstatus, der detekterer fluorescerende prober i 15 minutter, og derefter vil de blive analyseret ved hjælp af flowcytometri. Derudover vil et flerfarvet panel til flowcytometri baseret på cluster of differentiation (CD) antigener detektion, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 og CD14/CD16, blive designet til at analysere procentdelen af ​​lymfocyt T-subpopulationer (naive T-celler) (TN), central hukommelse (TCM), effektorhukommelse (TEM) og terminalt differentierede (TEMRA) celler) og monocytter subpopulationer (klassisk, ikke-klassisk og mellemliggende), henholdsvis i blodprøver. I begge procedurer vil 10.000 hændelser blive erhvervet, og enkeltfarvning og FMO-kontroller for alle fluorokrom-konjugerede antistoffer i panelerne vil blive udført for at etablere tilstrækkelig kompensation og definere positive signaler.

Et parallelt pladeflowkammer, forbundet med et omvendt mikroskop, vil gøre det muligt for forskerne at måle neutrofil-endotelcelle-interaktioner in vitro. Gennem dette system vil leukocytsuspensionen opnået fra patienter blive perfunderet over et monolag af immortaliserede endotelceller (HUVEC/TERT 2) under betingelser, der simulerer blodgennemstrømning. Videoer vil efterfølgende blive analyseret for at bestemme flow, rullehastighed og fast adhæsion af leukocytter til endotelceller, som tidligere beskrevet (Antioxidanter. 11. august 2020; 9(8):734).

Ændringer i genekspressionsniveauer vil blive evalueret ved hjælp af Nanostring®-teknologi til nCounter®. For at opsummere vil total RNA blive ekstraheret fra PBMC'er ved hjælp af GeneAllR RibospinTM total kit, og startende fra 100-200 ng total RNA, Diagnostica Longwood, S.L. vil analysere det differentielle genekspressionsrespons og dermed opnå multipleksmetabolismepanelet.

Til differentiel genekspressionsanalyse af miRNA'er (DEG'er) vil RNA blive ekstraheret ved hjælp af miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen). Efter kortkædet RNA-ekstraktion vil biblioteker blive forberedt til sekventering ved hjælp af TruSeq Small RNA-biblioteksforberedelseskit (Illumina, Inc.). Biblioteker vil blive poolet ækvimolært og kvantificeret ved hjælp af KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit med Illumina Primer Premix, og gruppestørrelse vil blive målt ved hjælp af en bioanalyzer (Agilent). Endelig vil 2 nanomol af gruppen blive sekventeret på Illumina NovaSeq6000-platformen med en 1% PhiX-kontrol i FISABIO-faciliteterne. Biblioteker vil blive sekventeret ved hjælp af 2x100 bp kemi i en SP flow celle (Illumina, Inc). Efter multipleksing vil rådata blive behandlet ved hjælp af pipelinen "COMPSRA: a COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis".

DNA vil også blive ekstraheret fra plasma i henhold til "blod- og kropsvæskeprotokollen" for QIAamp-blodreagenssættet (QIAgen, Hilden, Tyskland); 400 μL plasma påføres hver søjle, DNA vil blive elueret i 200 μL medfølgende buffer og vil blive opbevaret ved -20°C indtil brug. mtDNA vil blive kvantificeret med omvendt transkription-kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) ved hjælp af specifikke primere til opnåelse af cirkulerende mtDNA-niveauer.

Dataanalyse vil blive udført med SPSS 17.0. Grupper vil blive sammenlignet ved hjælp af uparrede Students t-tests eller Mann-Whitney U-tests for henholdsvis parametriske og ikke-parametriske data. Ændringer efter intervention vil blive evalueret ved hjælp af parrede Students t-test eller Wilcoxon-test, afhængigt af variabelfordelingen. Pearson eller Spearman korrelationskoefficienter vil blive brugt til at måle styrken af ​​associationen mellem variabler. I multivariable regressionsmodeller vil forholdet mellem to eller flere forklarende variable (uafhængige variable) og en responsvariabel (afhængig variabel) blive evalueret ved at tilpasse en lineær ligning til de opnåede data. Kvalitative data vil blive udtrykt i procenter, og proportioner vil blive sammenlignet ved hjælp af en Chi-square test. Alle test vil bruge et 95 % konfidensinterval, og forskelle vil blive betragtet som statistisk signifikante, når p <0,05.