Wpływ niechirurgicznego leczenia przyzębia na układ odpornościowy z perspektywy płci

Od pacjentów będą pobierane próbki krwi, płynu dziąsłowego (GCF) i śliny na początku badania oraz 12 tygodni po niechirurgicznym leczeniu przyzębia. Z próbek krwi na czczo (12 godzin) metodą immunomagnetyczną, zgodnie z protokołem producenta, zostaną wyizolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i frakcje neutrofilów, a osocze i surowica będą przechowywane do czasu analizy w temperaturze -80°C. LUNA-FL będzie używana do określenia liczby i żywotności komórek (podwójne barwienie oranżem akrydynowym i jodkiem propidyny) w próbkach komórek. Próbki GCF będą pobierane dwukrotnie poprzez ostrożne wprowadzenie sterylnych ćwieków papierowych do kieszonki przyzębnej na głębokość 1 mm na 30 s. Objętość zostanie określona przy użyciu Periotron 8000 i przechowywana w temperaturze -80°C do przyszłych oznaczeń. Niestymulowana ślina będzie zbierana do probówek wolnych od RNazy poprzez odkrztuszanie, a po odwirowaniu supernatant będzie przechowywany w temperaturze -80°C w celu analizy mikroRNA (miRNA).

Kliniczne parametry przyzębia dotyczące głębokości kieszonek sondujących (PD), milimetrów klinicznego poziomu przyczepu (CAL), krwawienia podczas sondowania (BOP), uproszczonego wskaźnika płytki nazębnej według Silnessa i Löe oraz uproszczonego wskaźnika kamienia nazębnego według Greene'a i Vermilliona zostaną określone przy użyciu konwencjonalnej instrukcji sonda periodontologiczna (UNC-15 PCP). Zostanie przeprowadzone badanie periodontologiczne w celu pomiaru PD, CAL i BOP w sześciu miejscach na ząb dla wszystkich zębów, z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, jak opisano wcześniej. Pacjenci zostaną przesłuchani na temat ich historii medycznej, nawyków związanych ze stylem życia (palenie tytoniu, częstotliwość mycia zębów, aktywność fizyczna) i cech socjodemograficznych. Masa ciała, wzrost i ciśnienie krwi będą mierzone przy użyciu standardowych metod. Biochemiczne parametry metabolizmu węglowodanów – glukoza, insulina, hemoglobina glikowana (A1c) –, profil lipidowy – cholesterol całkowity, LDL, HDL, trójglicerydy (TG), apolipoproteiny AI i B –, pojawiające się markery stanu zapalnego i ryzyka sercowo-naczyniowego – białko C-reaktywne ( CRP), C3c i białko wiążące retinol 4 (RBP4), a także pełną morfologię krwi zostaną oznaczone w szpitalnym dziale analiz klinicznych.

W celu wykrycia różnic w ekspresji białka komórki będą inkubowane w buforze do lizy z inhibitorami proteaz i fosfatazy (bufor RIPA) przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza (°C). Supernatant zostanie zebrany po wirowaniu przez 15 minut przy 16 000 g. Całkowite stężenie białka będzie oznaczane ilościowo za pomocą testu białkowego z kwasem bicynchinowym (BCA). Porcje 25 µg białka zostaną rozdzielone na żelach poliakryloamidowych z gradientem 8-16% i przeniesione na membrany nitrocelulozowe. Białka docelowe będą wykrywane poprzez inkubację błon z anty-aktyną, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, prokaspazą 1, kaspazą 1, oksydazą NADPH, katalazą, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alfa, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, Complex I, II, III, IV i V. Sygnał białka będzie wykrywany metodą chemiluminescencji i analizowany metodą densytometryczną.

Składanie kompleksu inflammasomu (pierwszy etap aktywacji) poprzez badania kolokalizacji NLRP3-ASC w PBMC zostaną przeprowadzone przy użyciu mikroskopii konfokalnej i/lub fluorescencyjnej. W skrócie, PBMC zostaną wysiane na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną, utrwalone 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut, permeabilizowane Tritonem X-100 przez 20 minut i blokowane buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami - albuminą surowicy bydlęcej ( PBS-BSA) 3% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Hybrydyzacja ze specyficznymi przeciwciałami pierwotnymi (rozcieńczonymi w PBS-BSA 1%) zostanie przeprowadzona przez noc w temperaturze 4°C, a następnie przeciwciała wtórne skoniugowane z fluoroforami AlexaFluor będą inkubowane przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Zabarwione próbki zostaną przeniesione szkiełko nakrywkowe na szkiełko mikroskopowe i zakonserwowane w odpornym na blaknięcie fluorescencyjnym podłożu do mocowania.

W próbkach surowicy będzie mierzony poziom krążących cytokin, cząsteczek adhezyjnych i markerów stresu oksydacyjnego w surowicy, ale do badań sekretomu 1x10^6 komórek PBMC będzie wcześniej inkubowanych w 1 ml RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez 4 godziny (37°C). C, 5% CO2) w celu otrzymania supernatantu. Zarówno surowice, jak i supernatanty będą analizowane za pomocą systemu analizatora Luminex® 200 zgodnie z procedurą producenta zestawu Milliplex® MAP. Te same oznaczenia zostaną przeprowadzone na próbkach GCF i surowicy/osocza od pacjentów.

Ocena ilościowa funkcjonalnych autofagosomów w komórkach PBMC zostanie przeprowadzona przy użyciu cytometrii przepływowej na naszym sprzęcie BD Accuri z zestawem do wykrywania CYTO-ID® Autophagy, zgodnie z procedurą producenta. Równolegle leukocyty z próbek krwi pełnej będą inkubowane przez 15 minut z sondami fluorescencyjnymi wykrywającymi stan redoks, a następnie zostaną poddane analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowo wielokolorowe panele do cytometrii przepływowej opartej na detekcji antygenów klastra różnicowania (CD), CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 i CD14/CD16, zostaną zaprojektowane w celu analizy odsetka subpopulacji limfocytów T (naiwnych limfocytów T) (TN), pamięć centralna (TCM), pamięć efektorowa (TEM) i komórki terminalnie zróżnicowane (TEMRA)) oraz subpopulacje monocytów (klasyczne, nieklasyczne i pośrednie) odpowiednio w próbkach krwi. W obu procedurach zostanie zebranych 10000 zdarzeń i przeprowadzone zostanie pojedyncze barwienie i kontrole FMO dla wszystkich przeciwciał skoniugowanych z fluorochromem w panelach w celu ustalenia odpowiedniej kompensacji i zdefiniowania sygnałów dodatnich.

Równoległa komora przepływowa płytkowa podłączona do mikroskopu odwróconego umożliwi naukowcom pomiar interakcji neutrofile-komórki śródbłonka in vitro. Dzięki temu systemowi zawiesina leukocytów uzyskana od pacjentów będzie perfundowana przez monowarstwę unieśmiertelnionych komórek śródbłonka (HUVEC/TERT 2) w warunkach symulujących przepływ krwi. Filmy zostaną później przeanalizowane w celu określenia przepływu, prędkości toczenia i silnej adhezji leukocytów do komórek śródbłonka, jak opisano wcześniej (Antioksydant. 11 sierpnia 2020 r.;9(8):734).

Zmiany w poziomach ekspresji genów zostaną ocenione przy użyciu technologii Nanostring® dla nCounter®. Podsumowując, całkowity RNA będzie ekstrahowany z PBMC przy użyciu zestawu GeneAllR RibospinTM total i zaczynając od 100-200 ng całkowitego RNA, Diagnostica Longwood, S.L. przeanalizuje zróżnicowaną odpowiedź ekspresji genów, uzyskując w ten sposób panel metabolizmu multipleksowego.

Do analizy różnicowej ekspresji genów miRNA (DEG) RNA będzie ekstrahowane przy użyciu zestawu miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen). Po ekstrakcji krótkołańcuchowego RNA biblioteki zostaną przygotowane do sekwencjonowania przy użyciu zestawu do przygotowania biblioteki TruSeq Small RNA (Illumina, Inc). Biblioteki zostaną równomolowo połączone w pulę i określone ilościowo przy użyciu zestawu KAPA SYBR FAST Universal qPCR z dodatkiem Illumina Primer Premix, a wielkość grupy zostanie zmierzona przy użyciu Bioanalyzer (Agilent). Na koniec 2 nanomole grupy zostaną zsekwencjonowane na platformie Illumina NovaSeq6000 z 1% kontrolą PhiX w obiektach FISABIO. Biblioteki będą sekwencjonowane przy użyciu chemii 2x100 bp w kuwecie przepływowej SP (Illumina, Inc). Po multipleksowaniu surowe dane będą przetwarzane przy użyciu potoku „COMPSRA: kompleksowa platforma do analizy danych Small RNA-Seq”.

DNA zostanie również pobrane z osocza zgodnie z „protokołem krwi i płynów ustrojowych” zestawu odczynników krwi QIAamp (QIAgen, Hilden, Niemcy); Do każdej kolumny zostanie naniesione 400 µl osocza, DNA zostanie wyeluowane w 200 µl dostarczonego buforu i będzie przechowywane w temperaturze -20°C do czasu użycia. mtDNA będzie oznaczane ilościowo za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) przy użyciu specyficznych starterów w celu uzyskania poziomów krążącego mtDNA.

Analiza danych zostanie przeprowadzona za pomocą SPSS 17.0. Grupy zostaną porównane przy użyciu niesparowanych testów t-Studenta lub testów U Manna-Whitneya, odpowiednio dla danych parametrycznych i nieparametrycznych. Zmiany po interwencji zostaną ocenione za pomocą testów t-Studenta dla par lub testów Wilcoxona, w zależności od rozkładu zmiennych. Do pomiaru siły powiązania między zmiennymi zostaną użyte współczynniki korelacji Pearsona lub Spearmana. W modelach regresji wielowymiarowej związek pomiędzy dwiema lub większą liczbą zmiennych objaśniających (zmiennych niezależnych) a zmienną odpowiedzi (zmienną zależną) będzie oceniany poprzez dopasowanie równania liniowego do uzyskanych danych. Dane jakościowe zostaną wyrażone w procentach, a proporcje zostaną porównane za pomocą testu Chi-kwadrat. We wszystkich testach zastosowany zostanie 95% przedział ufności, a różnice zostaną uznane za istotne statystycznie, gdy p < 0,05.