Effect van niet-chirurgische parodontale behandeling op het immuunsysteem vanuit genderperspectief

Er zullen bloed-, gingivale creviculaire vloeistof (GCF) en speekselmonsters worden verzameld van patiënten bij aanvang en 12 weken na de niet-chirurgische parodontale behandeling. Uit nuchtere bloedmonsters (12 uur) zullen perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) en neutrofielfracties worden geïsoleerd met behulp van een immunomagnetische methode, volgens het protocol van de fabrikant, en plasma en serum zullen tot analyse bij -80°C worden bewaard. LUNA-FL zal worden gebruikt om het aantal cellen en de levensvatbaarheid (dubbele kleuring van acridine-oranje en propidiumjodide) in celmonsters te bepalen. GCF-monsters worden in tweevoud verzameld door zorgvuldig steriele papieren punten gedurende 30 seconden 1 mm in de parodontale pocket te plaatsen. Het volume zal worden bepaald met behulp van de Periotron 8000 en bij -80°C worden bewaard voor toekomstige bepalingen. Ongestimuleerd speeksel zal worden verzameld in RNase-vrije buizen door middel van slijm, en na centrifugatie zal het supernatant worden bewaard bij -80°C voor microRNA (miRNA)-analyse.

Klinische parodontale parameters van de diepte van de pocketpockets (PD), millimeters klinisch hechtingsniveau (CAL), bloeding bij sonderen (BOP), vereenvoudigde plaque-index van Silness en Löe, en vereenvoudigde calculusindex van Greene en Vermillion zullen worden bepaald met behulp van een conventionele handleiding parodontale sonde (UNC-15 PCP). Er zal een parodontaal onderzoek worden uitgevoerd om PD, CAL en BOP te meten op zes plaatsen per tand voor alle tanden, met uitzondering van derde kiezen, zoals eerder beschreven. Patiënten zullen worden geïnterviewd over hun medische geschiedenis, levensstijlgewoonten (roken, frequentie van tandenpoetsen, fysieke activiteit) en sociaaldemografische kenmerken. Gewicht, lengte en bloeddruk worden gemeten met behulp van gestandaardiseerde methoden. Biochemische parameters van het koolhydraatmetabolisme - glucose, insuline, geglyceerd hemoglobine (A1c) -, lipidenprofiel - totaal cholesterol, LDL, HDL, triglyceriden (TG), apolipoproteïnen AI en B -, opkomende inflammatoire en cardiovasculaire risicomarkers - C-reactief proteïne ( CRP), C3c en retinol-bindend proteïne 4 (RBP4) - en het volledige bloedbeeld zullen worden bepaald door de Klinische Analysedienst van het ziekenhuis.

Voor detectie van verschillen in eiwitexpressie worden cellen gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius (°C) geïncubeerd in lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers (RIPA-buffer). Het supernatant wordt verzameld na 15 minuten centrifugeren bij 16.000 g. De totale eiwitconcentratie zal worden gekwantificeerd met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest. Porties van 25 µg eiwit zullen worden opgelost op SDS-polyacrylamidegels met een gradiënt van 8-16% en overgebracht naar nitrocellulosemembranen. Doeleiwitten zullen worden gedetecteerd door de membranen te incuberen met anti-actine, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspase 1, NADPH-oxidase, catalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alpha, mTFA, VDAC, Complex I, II, III, IV en V. Het eiwitsignaal zal worden gedetecteerd door chemiluminescentie en geanalyseerd door densitometrie.

Inflammasoomcomplexassemblage (eerste fase van activering) door middel van co-lokalisatiestudies van NLRP3-ASC in PBMC's zal worden uitgevoerd met behulp van confocale en/of fluorescentiemicroscopie. In het kort zullen PBMC's worden gezaaid op dekglaasjes bedekt met Poly-D-Lysine, gefixeerd met paraformaldehyde (PFA) 4% gedurende 20 minuten, gepermeabiliseerd met Triton X-100 gedurende 20 minuten en geblokkeerd met fosfaatgebufferde zoutbuffer-runderserumalbumine. PBS-BSA) 3% gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Hybridisatie met specifieke primaire antilichamen (verdund in PBS-BSA 1%) zal gedurende de nacht bij 4 ºC worden uitgevoerd en vervolgens zullen secundaire antilichamen geconjugeerd met AlexaFluor-fluoroforen gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Gekleurde monsters worden op het dekglaasje overgebracht op een microscoopglaasje en geconserveerd in anti-fade fluorescentie-montagemedium.

Circulerende niveaus van cytokinen, adhesiemoleculen en serumoxidatieve stressmarkers zullen worden gemeten in serummonsters, maar voor secretoomonderzoeken zullen 1x10^6 PBMC's eerder worden geïncubeerd in 1 ml RPMI met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 4 uur (37°C). C, 5% CO2) om het supernatant te verkrijgen. Zowel serums als supernatanten zullen worden geanalyseerd met een Luminex® 200-analysesysteem volgens de procedure van de fabrikant van de Milliplex® MAP Kit. Dezelfde bepalingen zullen worden uitgevoerd op GCF- en serum-/plasmamonsters van patiënten.

De kwantificering van functionele autofagosomen in PBMC's zal worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie op onze BD Accuri-apparatuur met de CYTO-ID® Autophagy-detectiekit volgens de procedure van de fabrikant. Tegelijkertijd zullen leucocyten uit volbloedmonsters gedurende 15 minuten worden geïncubeerd met fluorescente probes die de redoxstatus detecteren en vervolgens worden ze geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Daarnaast zullen er meerkleurige panelen voor flowcytometrie, gebaseerd op de detectie van cluster van differentiatie (CD) antigenen, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 en CD14/CD16, worden ontworpen om het percentage lymfocyten-T-subpopulaties (naïeve T-cellen) te analyseren. (TN), centraal geheugen (TCM), effectorgeheugen (TEM) en terminaal gedifferentieerde (TEMRA) cellen) en subpopulaties van monocyten (klassiek, niet-klassiek en gemiddeld), in bloedmonsters. In beide procedures zullen 10.000 gebeurtenissen worden geregistreerd en zullen enkele kleuring en FMO-controles voor alle fluorochroom-geconjugeerde antilichamen in de panels worden uitgevoerd om adequate compensatie vast te stellen en positieve signalen te definiëren.

Een parallelle plaatstroomkamer, verbonden met een omgekeerde microscoop, zal de onderzoekers in staat stellen de interacties tussen neutrofielen en endotheelcellen in vitro te meten. Via dit systeem zal de van patiënten verkregen leukocytensuspensie worden geperfuseerd over een monolaag van onsterfelijk gemaakte endotheelcellen (HUVEC/TERT 2) onder omstandigheden die de bloedstroom simuleren. Video's zullen daarna worden geanalyseerd om de stroom, de rolsnelheid en de stevige adhesie van leukocyten aan endotheelcellen te bepalen, zoals eerder beschreven (Antioxidanten. 11 augustus 2020;9(8):734).

Veranderingen in genexpressieniveaus zullen worden geëvalueerd met behulp van Nanostring®-technologie voor nCounter®. Samenvattend: totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit PBMC's met behulp van de GeneAllR RibospinTM totaalkit, en beginnend met 100-200 ng totaal RNA, Diagnostica Longwood, S.L. zal de differentiële genexpressierespons analyseren, waardoor het multiplexmetabolismepaneel wordt verkregen.

Voor differentiële genexpressieanalyse van miRNA's (DEG's) zal RNA worden geëxtraheerd met behulp van de miRNeasy Serum/Plasma-kit (Qiagen). Na RNA-extractie met een korte keten zullen bibliotheken worden voorbereid voor sequencing met behulp van de TruSeq Small RNA-bibliotheekvoorbereidingskit (Illumina, Inc). Bibliotheken zullen equimolair worden samengevoegd en gekwantificeerd met behulp van de KAPA SYBR FAST Universal qPCR-kit met Illumina Primer Premix, en de groepsgrootte zal worden gemeten met behulp van een Bioanalyzer (Agilent). Ten slotte zullen 2 nanomol van de groep worden gesequenced op het Illumina NovaSeq6000-platform met een 1% PhiX-controle in de FISABIO-faciliteiten. Van bibliotheken zal de sequentie worden bepaald met behulp van 2x100 bp chemie in een SP-stroomcel (Illumina, Inc). Na het multiplexen worden de ruwe gegevens verwerkt met behulp van de pijplijn "COMPSRA: a COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis".

DNA zal ook uit plasma worden geëxtraheerd volgens het "bloed- en lichaamsvloeistofprotocol" van de QIAamp-bloedreagensset (QIAgen, Hilden, Duitsland); Op elke kolom wordt 400 μl plasma aangebracht, het DNA wordt geëlueerd in 200 μl meegeleverde buffer en tot gebruik bij -20°C bewaard. mtDNA zal worden gekwantificeerd met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van specifieke primers voor het verkrijgen van circulerende mtDNA-niveaus.

Data-analyse zal worden uitgevoerd met SPSS 17.0. Groepen zullen worden vergeleken met behulp van ongepaarde Student's t-tests of Mann-Whitney U-tests voor respectievelijk parametrische en niet-parametrische gegevens. Veranderingen na interventie zullen worden geëvalueerd met behulp van gepaarde Student's t-tests of Wilcoxon-tests, afhankelijk van de variabele distributie. Pearson- of Spearman-correlatiecoëfficiënten zullen worden gebruikt om de sterkte van de associatie tussen variabelen te meten. In multivariabele regressiemodellen wordt de relatie tussen twee of meer verklarende variabelen (onafhankelijke variabelen) en een responsvariabele (afhankelijke variabele) geëvalueerd door een lineaire vergelijking aan de verkregen gegevens toe te passen. Kwalitatieve gegevens worden uitgedrukt in percentages en verhoudingen worden vergeleken met behulp van een Chi-kwadraattoets. Bij alle tests wordt een betrouwbaarheidsinterval van 95% gebruikt, en verschillen worden als statistisch significant beschouwd als p < 0,05.