Effekt av ikke-kirurgisk periodontal behandling på immunsystemet fra et kjønnsperspektiv

Blod, gingival crevicular væske (GCF) og spyttprøver vil bli samlet inn fra pasienter ved baseline og 12 uker etter ikke-kirurgisk periodontal behandling. Fra fastende blodprøver (12 timer), vil perifere mononukleære blodceller (PBMC) og nøytrofile fraksjoner bli isolert ved hjelp av en immunomagnetisk metode, i henhold til produsentens protokoll, og plasma og serum vil bli lagret ved -80°C frem til analyse. LUNA-FL vil bli brukt til å bestemme celletall og levedyktighet (akridin oransje og propidiumjodid dobbeltfarging) i celleprøver. GCF-prøver vil bli samlet inn i duplikat ved å sette sterile papirpunkter forsiktig inn i periodontallommen 1 mm i 30 s. Volumet vil bli bestemt ved å bruke Periotron 8000 og lagret ved -80°C for fremtidige bestemmelser. Ustimulert spytt vil bli samlet i RNase-frie rør ved ekspektorasjon, og etter sentrifugering vil supernatanten lagres ved -80 °C for mikroRNA (miRNA) analyse.

Kliniske periodontale parametere for sonderingslommers dybde (PD), millimeter av klinisk festenivå (CAL), blødning ved sondering (BOP), forenklet plakkindeks for Silness og Löe, og forenklet kalkulusindeks for Greene og Vermillion vil bli bestemt ved hjelp av en konvensjonell manual periodontal sonde (UNC-15 PCP). En periodontal undersøkelse vil bli utført for å måle PD, CAL og BOP på seks steder per tann for alle tenner, unntatt tredje molarer, som tidligere beskrevet. Pasientene vil bli intervjuet om deres sykehistorie, livsstilsvaner (røyking, hyppighet av tannpuss, fysisk aktivitet) og sosiodemografiske egenskaper. Vekt, høyde og blodtrykk vil bli målt ved hjelp av standardiserte metoder. Biokjemiske parametere for karbohydratmetabolisme - glukose, insulin, glykert hemoglobin (A1c) -, lipidprofil - totalt kolesterol, LDL, HDL, triglyserider (TG), apolipoproteiner AI og B -, nye inflammatoriske og kardiovaskulære risikomarkører - C-reaktivt protein ( CRP), C3c og retinolbindende protein 4 (RBP4) - og fullstendig blodtelling vil bli bestemt ved sykehusets kliniske analysetjeneste.

For påvisning av forskjeller i proteinuttrykk vil cellene bli inkubert i lyseringsbuffer med protease- og fosfatasehemmere (RIPA-buffer) i 15 minutter ved 4 grader celsius (°C). Supernatanten vil bli samlet opp etter sentrifugering i 15 minutter ved 16 000 g. Den totale proteinkonsentrasjonen vil bli kvantifisert ved hjelp av en bicinchoninsyre (BCA) proteinanalyse. Alikvoter på 25 µg protein vil bli løst på 8-16% gradient SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner. Målproteiner vil bli påvist ved å inkubere membranene med anti-aktin, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, procaspase 1, caspase 1, NADPH oksidase, katalase, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 alpha, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, Complex I, II, III, IV og V. Proteinsignalet vil bli oppdaget ved kjemiluminescens og analysert ved densitometri.

Inflammasomkomplekssammenstilling (første trinn av aktivering) gjennom samlokaliseringsstudier av NLRP3-ASC i PBMC-er vil bli utført ved bruk av konfokal- og/eller fluorescensmikroskopi. Kort fortalt vil PBMC-er bli sådd på dekkglass belagt med Poly-D-Lysine, fiksert med paraformaldehyd (PFA) 4% i 20 minutter, permeabilisert med Triton X-100 i 20 minutter og blokkering med fosfatbufret saltvannsbuffer-bovint serumalbumn ( PBS-BSA) 3 % i 1 time ved romtemperatur. Hybridisering med spesifikke primære antistoffer (fortynnet i PBS-BSA 1%) vil bli utført over natten ved 4 ºC, og deretter vil sekundære antistoffer konjugert med AlexaFluor-fluoroforer inkuberes i 1 time i mørket ved romtemperatur. Fargede prøver vil bli overført dekkglasset til objektglass og konservert i anti-fade fluorescens monteringsmedium.

Sirkulerende nivåer av cytokiner, adhesjonsmolekyler og oksidative stressmarkører i serum vil bli målt i serumprøver, men for sekretomstudier vil 1x10^6 PBMCer tidligere bli inkubert i 1 mL RPMI med 10 % føtalt bovint serum (FBS) i 4 timer (37°) C, 5 % CO2) for å oppnå supernatanten. Både serum og supernatanter vil bli analysert med et Luminex® 200 analysatorsystem etter Milliplex® MAP Kit-produsentens prosedyre. De samme bestemmelsene vil bli utført på GCF og serum/plasmaprøver fra pasienter.

Kvantifiseringen av funksjonelle autofagosomer i PBMC-er vil bli utført ved hjelp av flowcytometri på vårt BD Accuri-utstyr med CYTO-ID® Autophagy-deteksjonssettet etter produsentens prosedyre. Parallelt vil leukocytter fra fullblodsprøver bli inkubert med redoksstatus som detekterer fluorescerende prober i 15 minutter, og deretter vil de bli analysert ved hjelp av flowcytometri. I tillegg vil et flerfarget panel for flowcytometri basert på cluster of differentiation (CD) antigendeteksjon, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 og CD14/CD16, bli designet for å analysere prosentandelen av lymfocytt-T-subpopulasjoner (naive T-celler) (TN), sentralminne (TCM), effektorminne (TEM) og terminalt differensierte (TEMRA) celler) og monocytter subpopulasjoner (klassisk, ikke-klassisk og middels), henholdsvis i blodprøver. I begge prosedyrene vil 10 000 hendelser bli innhentet og enkeltfarging og FMO-kontroller for alle fluorokrom-konjugerte antistoffer i panelene vil bli utført for å etablere tilstrekkelig kompensasjon og definere positive signaler.

Et strømningskammer for parallell plate, koblet til et invertert mikroskop, vil gjøre det mulig for forskerne å måle interaksjoner mellom nøytrofil-endotelceller in vitro. Gjennom dette systemet vil leukocyttsuspensjonen oppnådd fra pasienter bli perfusert over et monolag av udødeliggjorte endotelceller (HUVEC/TERT 2) under forhold som simulerer blodstrøm. Videoer vil bli analysert etterpå for å bestemme flyt, rullehastighet og fast adhesjon av leukocytter til endotelceller, som tidligere beskrevet (Antioksidanter. 11. august 2020;9(8):734).

Endringer i genuttrykksnivåer vil bli evaluert ved hjelp av Nanostring®-teknologi for nCounter®. For å oppsummere, vil totalt RNA ekstraheres fra PBMCer ved å bruke GeneAllR RibospinTM totalsett, og starter fra 100-200 ng totalt RNA, Diagnostica Longwood, S.L. vil analysere den differensielle genekspresjonsresponsen, og dermed oppnå multipleksmetabolismepanelet.

For differensiell genekspresjonsanalyse av miRNA (DEGs), vil RNA ekstraheres ved bruk av miRNeasy Serum/Plasma-settet (Qiagen). Etter kortkjedet RNA-ekstraksjon, vil bibliotekene bli klargjort for sekvensering ved å bruke TruSeq Small RNA-bibliotekets forberedelsessett (Illumina, Inc.). Biblioteker vil bli slått sammen ekvimolært og kvantifisert ved hjelp av KAPA SYBR FAST Universal qPCR-settet med Illumina Primer Premix, og gruppestørrelsen vil bli målt ved hjelp av en bioanalyzer (Agilent). Til slutt vil 2 nanomol av gruppen bli sekvensert på Illumina NovaSeq6000-plattformen med en 1% PhiX-kontroll i FISBIO-fasilitetene. Biblioteker vil bli sekvensert ved hjelp av 2x100 bp kjemi i en SP flow celle (Illumina, Inc). Etter multipleksing vil rådata bli behandlet ved hjelp av pipelinen "COMPSRA: a COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis".

DNA vil også bli ekstrahert fra plasma i henhold til "blod- og kroppsvæskeprotokollen" til QIAamp-blodreagenssettet (QIAgen, Hilden, Tyskland); 400 μL plasma vil påføres hver kolonne, DNA vil bli eluert i 200 μL medfølgende buffer og vil bli lagret ved -20°C frem til bruk. mtDNA vil bli kvantifisert med omvendt transkripsjonskvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved bruk av spesifikke primere for å oppnå sirkulerende mtDNA-nivåer.

Dataanalyse vil bli utført med SPSS 17.0. Grupper vil bli sammenlignet ved å bruke uparrede Students t-tester eller Mann-Whitney U-tester for henholdsvis parametriske og ikke-parametriske data. Endringer etter intervensjon vil bli evaluert ved å bruke sammenkoblede Students t-tester eller Wilcoxon-tester, avhengig av variabelfordelingen. Pearson eller Spearman korrelasjonskoeffisienter vil bli brukt for å måle styrken på assosiasjonen mellom variabler. I multivariable regresjonsmodeller vil forholdet mellom to eller flere forklaringsvariabler (uavhengige variabler) og en responsvariabel (avhengig variabel) bli evaluert ved å tilpasse en lineær ligning til de oppnådde dataene. Kvalitative data vil bli uttrykt i prosent, og proporsjoner vil bli sammenlignet ved hjelp av en chi-kvadrattest. Alle tester vil bruke et 95 % konfidensintervall, og forskjeller vil bli vurdert som statistisk signifikante når p <0,05.