성별 관점에서 본 비치주치료가 면역체계에 미치는 영향

혈액, 치은열구액(GCF) 및 타액 샘플은 기준 시점과 비수술적 치주 치료 후 12주 후에 환자로부터 수집됩니다. 공복 혈액 샘플(12시간)에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 호중구 분획은 제조업체의 프로토콜에 따라 면역자기 방법을 사용하여 분리되며, 혈장 및 혈청은 분석할 때까지 -80°C에서 보관됩니다. LUNA-FL은 세포 샘플의 세포 수와 생존력(아크리딘 오렌지 및 프로피듐 요오다이드 이중 염색)을 결정하는 데 사용됩니다. GCF 샘플은 30초 동안 1mm 치주 ​​포켓에 멸균 종이 포인트를 조심스럽게 삽입하여 이중으로 수집됩니다. 부피는 Periotron 8000을 사용하여 측정하고 향후 측정을 위해 -80°C에 보관합니다. 자극되지 않은 타액은 가담을 통해 RNase-free 튜브에 수집되고, 원심분리 후 상층액은 마이크로RNA(miRNA) 분석을 위해 -80°C에 보관됩니다.

프로빙 포켓 깊이(PD), 임상 부착 수준 밀리미터(CAL), 프로빙 시 출혈(BOP), Silness 및 Löe의 단순화된 플라크 지수, Greene 및 Vermillion의 단순화된 치석 지수 등의 임상 치주 매개변수는 기존 매뉴얼을 사용하여 결정됩니다. 치주 프로브(UNC-15 PCP). 앞서 설명한 대로 제3대구치를 제외한 모든 치아에 대해 치아당 6개 부위에서 PD, CAL 및 BOP를 측정하기 위해 치주 검사가 수행됩니다. 환자들은 병력, 생활 습관(흡연, 칫솔질 빈도, 신체 활동) 및 사회인구학적 특성에 대해 인터뷰하게 됩니다. 체중, 키, 혈압은 표준화된 방법을 사용하여 측정됩니다. 탄수화물 대사의 생화학적 매개변수 - 포도당, 인슐린, 당화혈색소(A1c) -, 지질 프로필 - 총 콜레스테롤, LDL, HDL, 중성지방(TG), 아포지단백질 AI 및 B -, 새로운 염증 및 심혈관 위험 지표 - C-반응성 단백질( CRP), C3c, 레티놀 결합 단백질 4(RBP4) - 및 전체 혈구 수치는 병원의 임상 분석 서비스에서 결정됩니다.

단백질 발현의 차이를 검출하기 위해 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 포함된 용해 완충액(RIPA 완충액)에서 섭씨 4도(°C)에서 15분간 배양합니다. 16,000g에서 15분간 원심분리한 후 상청액을 수집합니다. 총 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석을 사용하여 정량화됩니다. 25μg의 단백질 분취량은 8~16% 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨집니다. 표적 단백질은 항액틴, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, 프로카스파제 1, 카스파제 1, NADPH 산화효소, 카탈라제, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62와 함께 막을 배양하여 검출됩니다. , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alpha, IRE1 알파, ATF6, CHOP, PGC1 알파, mTFA, VDAC, 복합체 I, II, III, IV 및 V. 단백질 신호는 화학발광으로 검출하고 농도계로 분석합니다.

PBMC에서 NLRP3-ASC의 공동 위치화 연구를 통한 인플라마솜 복합체 조립(활성화의 첫 번째 단계)은 공초점 및/또는 형광 현미경을 사용하여 수행됩니다. 간략하게, PBMC는 폴리-D-라이신으로 코팅된 커버슬립에 시딩하고, 파라포름알데히드(PFA) 4%로 20분 동안 고정하고, Triton X-100으로 20분 동안 투과시키고 인산염 완충 식염수 완충액-소 혈청 알부민으로 차단합니다( PBS-BSA) 3%, 실온에서 1시간 동안. 특정 1차 항체(PBS-BSA 1%로 희석)와의 혼성화는 4°C에서 밤새 수행되며 AlexaFluor 형광단과 결합된 2차 항체는 실온의 암실에서 1시간 동안 배양됩니다. 염색된 샘플은 커버슬립을 현미경 슬라이드로 옮기고 퇴색 방지 형광 장착 매체에 보존됩니다.

사이토카인, 부착 분자 및 혈청 산화 스트레스 마커의 순환 수준은 혈청 샘플에서 측정되지만, 분비물 연구의 경우 1x10^6 PBMC는 사전에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 1mL RPMI에서 4시간(37°) 동안 배양됩니다. C, 5% CO2)를 사용하여 상층액을 얻습니다. 혈청과 상층액 모두 Milliplex® MAP Kit 제조업체의 절차에 따라 Luminex® 200 분석기 시스템으로 분석됩니다. 이와 동일한 결정이 환자의 GCF 및 혈청/혈장 샘플에 대해 수행됩니다.

PBMC에서 기능성 자가포식소체의 정량화는 제조업체의 절차에 따라 CYTO-ID® Autophagy 검출 키트가 포함된 BD Accuri 장비의 유세포 분석기를 사용하여 수행됩니다. 이와 동시에 전혈 샘플의 백혈구를 산화환원 상태 감지 형광 프로브와 함께 15분 동안 배양한 다음 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다. 또한, 분화(CD) 항원 검출 클러스터, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 및 CD14/CD16을 기반으로 하는 유세포 분석용 다색 패널은 림프구 T 하위 모집단(순진한 T 세포)의 비율을 분석하도록 설계됩니다. (TN), 중앙 기억(TCM), 효과기 기억(TEM) 및 최종 분화(TEMRA) 세포) 및 단핵구 하위 집단(고전, 비고전 및 중간)이 각각 혈액 샘플에 포함되어 있습니다. 두 절차 모두에서 10000개의 이벤트가 획득되고 패널의 모든 형광색소 결합 항체에 대한 단일 염색 및 FMO 제어가 수행되어 적절한 보상을 설정하고 양성 신호를 정의합니다.

역현미경에 연결된 평행판 흐름 챔버를 통해 연구원들은 시험관 내에서 호중구-내피 세포 상호 작용을 측정할 수 있습니다. 이 시스템을 통해 환자로부터 얻은 백혈구 현탁액은 혈류를 시뮬레이션하는 조건 하에서 불멸화 내피 세포(HUVEC/TERT 2)의 단층 위에 관류됩니다. 이전에 설명한 대로(항산화제. 2020년 8월 11;9(8):734).

유전자 발현 수준의 변화는 nCounter®용 Nanostring® 기술을 사용하여 평가됩니다. 요약하자면, GeneAllR Ribospin™ 총 키트를 사용하여 PBMC에서 총 RNA를 추출하고 100-200 ng의 총 RNA(Diagnosica Longwood, S.L.)부터 시작합니다. 차별적인 유전자 발현 반응을 분석하여 다중 대사 패널을 얻습니다.

miRNA(DEG)의 차별적 유전자 발현 분석을 위해 miRNeasy Serum/Plasma 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출합니다. 단쇄 RNA 추출 후 TruSeq Small RNA 라이브러리 준비 키트(Illumina, Inc)를 사용하여 시퀀싱을 위해 라이브러리가 준비됩니다. 라이브러리는 등몰로 모아지고 Illumina Primer Premix가 포함된 KAPA SYBR FAST Universal qPCR 키트를 사용하여 정량화되며 그룹 크기는 Bioanalyzer(Agilent)를 사용하여 측정됩니다. 마지막으로 그룹의 2나노몰은 FISABIO 시설에서 1% PhiX 제어 기능을 갖춘 Illumina NovaSeq6000 플랫폼에서 시퀀싱됩니다. 라이브러리는 SP 플로우 셀(Illumina, Inc)에서 2x100bp 화학을 사용하여 서열 분석됩니다. 다중화 후 원시 데이터는 "COMPSRA: 소형 RNA-Seq 데이터 분석을 위한 종합 플랫폼" 파이프라인을 사용하여 처리됩니다.

DNA는 또한 QIAamp 혈액 시약 세트(QIAgen, Hilden, Germany)의 "혈액 및 체액 프로토콜"에 따라 혈장에서 추출됩니다. 400 μL의 혈장이 각 컬럼에 적용되고, DNA는 200 μL의 제공된 완충액에서 용출되며 사용할 때까지 -20°C에서 보관됩니다. mtDNA는 순환하는 mtDNA 수준을 얻기 위해 특정 프라이머를 사용하여 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)으로 정량화됩니다.

데이터 분석은 SPSS 17.0을 사용하여 수행됩니다. 그룹은 파라메트릭 데이터와 비모수 데이터에 대해 각각 unpaired Student's t-test 또는 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 비교됩니다. 중재 후 변화는 변수 분포에 따라 쌍을 이루는 Student's t-test 또는 Wilcoxon 테스트를 사용하여 평가됩니다. Pearson 또는 Spearman 상관 계수는 변수 간의 연관성 강도를 측정하는 데 사용됩니다. 다변수 회귀 모델에서는 두 개 이상의 설명 변수(독립 변수)와 응답 변수(종속 변수) 사이의 관계가 얻은 데이터에 선형 방정식을 적용하여 평가됩니다. 정성적 데이터는 백분율로 표시되며 카이제곱 테스트를 사용하여 비율을 비교합니다. 모든 테스트는 95% 신뢰구간을 사용하며, p<0.05일 때 차이는 통계적으로 유의미한 것으로 간주됩니다.