Vliv nechirurgické parodontologické léčby na imunitní systém z genderové perspektivy

Vzorky krve, gingivální crevikulární tekutiny (GCF) a slin budou pacientům odebrány na začátku a 12 týdnů po nechirurgické periodontální léčbě. Ze vzorků krve nalačno (12 hodin) budou izolovány mononukleární buňky periferní krve (PBMC) a frakce neutrofilů pomocí imunomagnetické metody podle protokolu výrobce a plazma a sérum budou až do analýzy skladovány při -80 °C. LUNA-FL bude použit ke stanovení počtu buněk a životaschopnosti (dvojité barvení akridinovou oranží a propidium jodidem) v buněčných vzorcích. Vzorky GCF budou odebírány duplicitně opatrným vložením hrotů sterilního papíru do periodontální kapsy 1 mm po dobu 30 sekund. Objem bude stanoven pomocí Periotron 8000 a uložen při -80 °C pro budoucí stanovení. Nestimulované sliny se odeberou do zkumavek bez RNázy vykašláváním a po centrifugaci se supernatant uloží při -80 °C pro analýzu mikroRNA (miRNA).

Klinické periodontální parametry hloubky kapes sondy (PD), milimetry úrovně klinického přilnutí (CAL), krvácení při sondování (BOP), zjednodušený index plaku Silness a Löe a zjednodušený index zubního kamene u Greenea a Vermillionu budou stanoveny pomocí konvenční příručky periodontální sonda (UNC-15 PCP). Bude provedeno periodontální vyšetření za účelem měření PD, CAL a BOP na šesti místech na zub u všech zubů, kromě třetích molárů, jak bylo popsáno dříve. Pacienti budou dotazováni na jejich anamnézu, životní návyky (kouření, frekvence čištění zubů, fyzická aktivita) a sociodemografické charakteristiky. Hmotnost, výška a krevní tlak budou měřeny pomocí standardizovaných metod. Biochemické parametry metabolismu sacharidů - glukóza, inzulín, glykovaný hemoglobin (A1c) -, lipidový profil - celkový cholesterol, LDL, HDL, triglyceridy (TG), apolipoproteiny AI a B -, nově vznikající markery zánětlivého a kardiovaskulárního rizika - C-Reaktivní protein ( CRP), C3c a protein vázající retinol 4 (RBP4) - a kompletní krevní obraz budou stanoveny ve službě klinické analýzy nemocnice.

Pro detekci rozdílů v expresi proteinu budou buňky inkubovány v lyzačním pufru s inhibitory proteázy a fosfatázy (RIPA pufr) po dobu 15 minut při 4 stupních Celsia (°C). Supernatant se shromáždí po 15 minutové centrifugaci při 16 000 g. Celková koncentrace proteinu bude kvantifikována pomocí proteinového testu s bicinchonovou kyselinou (BCA). Alikvoty 25 ug proteinu budou rozděleny na 8-16% gradient SDS-polyakrylamidových gelů a přeneseny na nitrocelulózové membrány. Cílové proteiny budou detekovány inkubací membrán s anti-aktinem, JNK, NFkB, MCP1, GPX-1, NLRP3, ASC, prokaspázou 1, kaspázou 1, NADPH oxidázou, katalázou, GPX1, SOD1, Beclin, ATG5-ATG12, p62 , LC3 I, LC3 II, Pink1, GRP78, eIF2alfa, IRE1 alfa, ATF6, CHOP, PGC1 alfa, mTFA, VDAC, komplex I, II, III, IV a V. Proteinový signál bude detekován chemiluminiscencí a analyzován denzitometrií.

Sestavení inflammasomového komplexu (první fáze aktivace) prostřednictvím studií společné lokalizace NLRP3-ASC v PBMC bude provedeno pomocí konfokální a/nebo fluorescenční mikroskopie. Stručně řečeno, PBMC se naočkují na krycí sklíčka potažená Poly-D-Lysinem, fixují se paraformaldehydem (PFA) 4% po dobu 20 minut, permeabilizují se Tritonem X-100 po dobu 20 minut a blokují se fyziologickým pufrem pufrovaným fosfátem-hovězí sérum album ( PBS-BSA) 3 % po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Hybridizace se specifickými primárními protilátkami (zředěnými v PBS-BSA 1%) bude provedena přes noc při 4 °C a poté budou sekundární protilátky konjugované s fluorofory AlexaFluor inkubovány po dobu 1 hodiny ve tmě při pokojové teplotě. Obarvené vzorky se přenesou krycím sklíčkem na mikroskopické sklíčko a zakonzervují se v fixačním médiu proti vyblednutí fluorescence.

Cirkulující hladiny cytokinů, adhezivních molekul a sérových markerů oxidačního stresu budou měřeny ve vzorcích séra, ale pro sekretomové studie bude 1x10^6 PBMC předem inkubováno v 1 ml RPMI s 10% fetálním bovinním sérem (FBS) po dobu 4 hodin (37° C, 5 % C02), aby se získal supernatant. Séra i supernatanty budou analyzovány systémem analyzátoru Luminex® 200 podle postupu výrobce Milliplex® MAP Kit. Stejná stanovení budou provedena na GCF a vzorcích séra/plazmy od pacientů.

Kvantifikace funkčních autofagozomů v PBMC bude provedena pomocí průtokové cytometrie na našem zařízení BD Accuri s detekční soupravou CYTO-ID® Autophagy podle postupu výrobce. Paralelně budou leukocyty ze vzorků plné krve inkubovány s fluorescenčními sondami detekujícími redoxní stav po dobu 15 minut a poté budou analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Kromě toho budou navrženy vícebarevné panely pro průtokovou cytometrii založené na detekci shluků diferenciačních (CD) antigenů, CD3/CD4/CD8/CD45RA/CCR7/CD38 a CD14/CD16, aby analyzovaly procento subpopulací lymfocytů T (naivních T buněk (TN), centrální paměť (TCM), efektorová paměť (TEM) a terminálně diferencované (TEMRA) buňky) a subpopulace monocytů (klasické, neklasické a střední) ve vzorcích krve. V obou postupech bude získáno 10 000 událostí a bude provedeno jedno barvení a kontroly FMO pro všechny protilátky konjugované s fluorochromem v panelech, aby se vytvořila adekvátní kompenzace a definovaly se pozitivní signály.

Průtoková komora s paralelními deskami, připojená k inverznímu mikroskopu, umožní výzkumníkům měřit interakce neutrofil-endoteliální buňky in vitro. Prostřednictvím tohoto systému bude suspenze leukocytů získaná od pacientů perfundována přes monovrstvu imortalizovaných endoteliálních buněk (HUVEC/TERT 2) za podmínek simulujících průtok krve. Videa budou následně analyzována za účelem stanovení průtoku, rychlosti odvalování a pevné adheze leukocytů k endoteliálním buňkám, jak bylo popsáno dříve (Antioxidanty. 11. srpna 2020; 9 (8): 734).

Změny v hladinách genové exprese budou hodnoceny pomocí technologie Nanostring® pro nCounter®. Abychom to shrnuli, celková RNA bude extrahována z PBMC pomocí celkové sady GeneAllR RibospinTM a počínaje 100-200 ng celkové RNA, Diagnostica Longwood, S.L. bude analyzovat rozdílnou odpověď genové exprese, čímž se získá panel multiplexního metabolismu.

Pro analýzu diferenciální genové exprese miRNA (DEG) bude RNA extrahována pomocí miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen). Po extrakci RNA s krátkým řetězcem budou knihovny připraveny pro sekvenování pomocí soupravy pro přípravu knihovny TruSeq Small RNA (Illumina, Inc). Knihovny budou spojeny ekvimolárně a kvantifikovány pomocí KAPA SYBR FAST Universal qPCR kitu s Illumina Primer Premix a velikost skupiny bude měřena pomocí Bioanalyzeru (Agilent). Nakonec budou 2 nanomoly skupiny sekvenovány na platformě Illumina NovaSeq6000 s 1% kontrolou PhiX v zařízeních FISABIO. Knihovny budou sekvenovány pomocí chemie 2x100 bp v průtokové cele SP (Illumina, Inc). Po multiplexování budou nezpracovaná data zpracována pomocí potrubí „COMPSRA: COMprehensive Platform for Small RNA-Seq data Analysis“.

DNA bude také extrahována z plazmy podle „protokolu krve a tělesných tekutin“ sady krevních činidel QIAamp (QIAgen, Hilden, Německo); Na každý sloupec bude aplikováno 400 μl plazmy, DNA bude eluována ve 200 μL dodaného pufru a bude uchovávána při -20 °C až do použití. mtDNA bude kvantifikována pomocí reverzní transkripce-kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR) za použití specifických primerů pro získání hladin cirkulující mtDNA.

Analýza dat bude provedena pomocí SPSS 17.0. Skupiny budou porovnány pomocí nepárových Studentových t-testů nebo Mann-Whitneyho U testů pro parametrická a neparametrická data. Změny po intervenci budou hodnoceny pomocí párových Studentových t-testů nebo Wilcoxonových testů v závislosti na distribuci proměnných. K měření síly asociace mezi proměnnými budou použity Pearsonovy nebo Spearmanovy korelační koeficienty. V modelech regrese s více proměnnými bude vztah mezi dvěma nebo více vysvětlujícími proměnnými (nezávisle proměnnými) a proměnnou odezvy (závisle proměnná) vyhodnocen tak, že získaná data dosadíme lineární rovnicí. Kvalitativní data budou vyjádřena v procentech a proporce budou porovnány pomocí Chi-kvadrát testu. Všechny testy budou používat 95% interval spolehlivosti a rozdíly budou považovány za statisticky významné, když p <0,05.