メキシコ患者における神経内分泌腫瘍の遺伝的基盤

導入。

NEN は、怠惰からあからさまな攻撃性や悪性腫瘍に至るまで、さまざまな臨床挙動を示す異質なヒト新生物のグループです。 それらは、ホルモンを産生する能力を共有する共通の発生学的起源を持つさまざまな組織から発生します。 それらの成長は周囲の構造を損なう可能性があり、関連するホルモン過剰分泌症候群により重大な罹患率を引き起こすことがよくあります。 従来、まれであると考えられていましたが、臨床認識と診断戦略の向上により、NEN の頻度はここ数十年で大幅に増加しました。 このグループには、気管支肺、胃腸、膵臓、胸腺の NEN、甲状腺髄様がん (MTC)、傍神経節腫および褐色細胞腫 (PPGL)、副甲状腺腺腫および副甲状腺がん、および下垂体神経内分泌腫瘍 (PitNET) などの病変が含まれます。

興味深いことに、NEN はヒトの新生物の中で最も強い遺伝要素を持つものの 1 つです。 一部の NEN は多発性内分泌腫瘍の常染色体優性症候群の一部であり、同じ個人および/または家族内の他の特徴的な内分泌腫瘍および非内分泌腫瘍と組み合わせて存在します。 このような実体の臨床的記述は 20 世紀半ば以降文献に存在しますが、その遺伝的原因は 30 ～ 40 年前まで判明していませんでした。 他の例では、MTC、PitNET、または PPGL などの単一タイプの腫瘍が、他の関連する特徴を持たずに、同じファミリーの複数のメンバーで発生します。 時折、明らかに散発的な症状を呈する個人が、実際に家族性疾患の単純な症例である場合があります。 現在、MTC 症例の約 50%、PPGL の 40%、胃腸、膵臓、気管支肺、および胸腺の NEN の 20%、副甲状腺の NEN の 15%、および PitNET の 5 ～ 10% が生殖細胞系列の欠陥によるものであることが知られています。 遺伝性の遺伝的欠陥とは別に、体細胞レベルでの変化は、散発性NENと家族性NENの両方における特定の臨床経過を決定します。

過去 10 年間、遺伝子解析のための強力なツールが広く使用されたことにより、NEN の既知の遺伝的原因が劇的に増加しました。 これらのアプローチはまた、以前は予想されていなかった遺伝子型と表現型の関連性をもたらし、多発性内分泌腫瘍症のさまざまな症候群の臨床症状における大きな重複を明らかにしました。 遺伝子検査は、早期診断、個別の臨床管理、遺伝カウンセリングの鍵となります。 さらに、腫瘍の遺伝子分析により、潜在的なバイオマーカーと治療標的が明らかになりました。 しかし、遺伝子診断のためのプラットフォームは広く利用可能ではなく、遺伝性疾患の要因に関するデータはすべての人類集団を正確に表しているわけではありません。 メキシコでは遺伝子検査は広く利用されておらず、約1億2,800万人の人口の大部分が入院している公立病院にはほとんど存在しません。 興味深いことに、メキシコ人口の大部分を占めるメスティーソは、遺伝的に最も多様な人類集団の 1 つです。 精密医療戦略には集団固有の情報が必要ですが、メキシコのメスティーソは国際的な遺伝子データベースにあまり掲載されていません。

目的。

このプロジェクトは、正確で堅牢かつ手頃な価格の検査プラットフォームを使用して、メキシコのメスティーソの大規模な将来コホートにおけるNENの生殖系列および体細胞遺伝的原因のレパートリーと頻度を説明します。 また、特定の遺伝子欠陥に関連する表現型と臨床転帰を定義し、これらの新生物に以前から関連付けられていた遺伝子の新たな欠陥の機能的影響を調査します。 最後に、潜在的な創薬可能性のある標的を含む、新たな遺伝的関連性を明らかにし、徹底的に特徴づけます。

方法。

この研究の承認は、2 つの参考病院の治験審査委員会から得られています: 国立科学医療栄養研究所 (INCMNSZ、プロジェクト 4090)、および国立シグロ医療専門病院 XXI、メキシコ国立セグロ社会研究所 ( InterScan MSS、プロジェクト R-2022-785-011)。 インフォームドコンセントの下、血液および新鮮な腫瘍またはホルマリン固定されパラフィン包埋された腫瘍から DNA サンプルが取得されます。 エクソーム配列決定を除くすべての実験方法は、メキシコ国立自治大学および INCMNSZ の研究支援ネットワークで実施されます。 この研究は2022年8月に開始され、推定合計750人の参加者による15年間の前向きコホートとして設計されています。 散発性、家族性、孤立性、症候群性を含む、あらゆるタイプの NEN の新規または以前の診断を受けた成人個人（採用時点で 18 歳以上）が参加するよう招待されます。 すべての参加者には、遺伝子研究の結果を得る機会が提供されます。 参加者の個人情報を保護するために、一意の匿名化コードを使用して、各参加者について収集されたすべてのサンプルとデータにラベルが付けられます。

各参加者の家族歴、臨床症状、生化学、画像、病理組織学的研究、および過去の遺伝的研究に関する詳細は、匿名化された電子臨床データベースに入力されます。 臨床転帰に関するデータは、最長 15 年間にわたって前向きに収集されます。 すべての場合において、リクルート時に 5 ml の末梢血サンプルを EDTA を含むチューブに収集し、処理するまで 4℃ で保存します。 採取後 24 時間以内に血液サンプルから DNA が抽出されます。 入手可能な場合は、過去に腫瘍切除を行った患者のアーカイブ用ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルが採取されます。 可能であれば、日常的な組織病理学的分析を妨げることなく、研究の過程で外科的腫瘍切除を受けた個体から新鮮な凍結組織サンプルを採取します。 凍結組織は、処理するまで液体窒素中で保管されます。 DNA はすべての組織サンプルから抽出され、RNA は特定の場合に血液または組織サンプルから抽出されます。 サンプルの品質と濃度は分光測光法と蛍光光度法によって分析されます。 研究期間中、DNA は -20 °C、RNA は -80 °C で保存されます。

DNA サンプルは、ターゲットを絞った次世代シーケンシング (NGS) の最初のステップ、その後のターゲット アレイベースの比較ゲノム ハイブリダイゼーション (aCGH) およびエクソーム シーケンシング (ES) からなる複数の手法を使用して分析されます。 NGS については、Twist Biosciences プラットフォームを使用して、NEN との関連が知られている 54 個の遺伝子を含むカスタマイズされたパネルが設計されました。 すべての参加者からの血液 DNA と、可能であれば新鮮な腫瘍 DNA からのライブラリーをメーカーの指示に従って調製し、Illumina MiSeq 装置でおよそ 300 倍の深さで配列決定します。 配列は GRCh38/hg38 ヒトゲノムにマッピングされ、PCR 重複がマークされ、一塩基変異体 (SNV)、インデル、およびコピー数変異体に対して変異体の呼び出しが実行されます。 変異体は、頻度 (一般人口データベースとメキシコ人口データベースの両方で 0.1% 未満)、ClinVar で報告された以前の分類 (米国医科遺伝ゲノミクス学会および分子病理学協会のガイドラインによる)、複数の結果に基づいて選択されます。コンピュータ予測ツール、および追加の臨床および実験データの文献検索。

NGSパネル後に遺伝子診断が行われずに残った選択された症例については、同じ標的領域のCNV分析が実行されます。 この目的のために、Agilent SureDesign プラットフォームを使用して、NGS パネルと同じ関心領域をターゲットとする高密度 aCGH が設計されました。 サンプルは 16 x 25 K アレイ形式で処理され、結果は Agilent Genomic Workbench ソフトウェアで分析されます。 バリアントのフィルタリングと分類は、SNV とインデルについて説明したのと同様の方法で行われます。

病原性および病原性の可能性があると分類されたすべての関連バリアントは、直交検証（SNV およびインデルについてはサンガー配列決定、CNV については液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応）の対象となります。 結果を知ることを選択したすべての参加者は、関連するすべての重要性不確実な変異体（VUS）、および可能性の高い病原性変異体および臨床的意義の解釈を含む病原性変異体を含む詳細なレポートを受け取ります。 臨床的に適応がある場合、参加者には追加の家族メンバーを対象としたカスケードスクリーニングが提供されます。 これまでに報告されていない変異体を含む選択された VUS は、腫瘍組織におけるヘテロ接合性の消失の検索、発現アッセイ、血液および/または腫瘍組織におけるコーディング DNA シークエンシングおよび/またはブレークポイント分析、または実験的機能検証を含む追加の評価を受けます。

遺伝的結果は臨床データと関連付けられ、研究対象集団の各表現型に関連する遺伝的欠陥の頻度と種類が決定されます。 逆に、それぞれの特定の遺伝的欠陥に関連する表現型のレパートリーの徹底的な臨床的説明が得られます。 臨床症状および臨床転帰に対する特定の遺伝子型と表現型の関連性の影響も調査されます。 標的NGSおよびaCGHの後に遺伝子診断が得られなかった症例は、エクソーム配列決定の対象となります。 同様の表現型を持つ患者のグループを一緒に分析して、これまでNENと関連付けられていなかった遺伝子の疾患特異的欠陥を特定する予定です。 新規候補の関連性は、実験的アプローチと罹患家族での追加スクリーニングのカスタム設計の組み合わせを使用して徹底的に特徴付けられます。

予想された結果。

一般的な遺伝子型判定のための提案された新しいプラットフォームに NEN の複数の表現型を組み込むことで、現在利用可能な遺伝子検査と比較して、変異検出の確率が大幅に向上します。 このプロジェクトは、研究対象集団におけるこれまで未調査の表現型に関する大量の遺伝データおよび臨床データを生成することに加えて、新規の疾患修飾因子および創始者変異体も特定する可能性が非常に高いです。 これらのデータは、遺伝カウンセリング、早期診断、臨床経過観察、治療のための集団および遺伝子型に特化した戦略の開発に貢献し、それによって NEN 患者の将来の転帰を改善します。 この戦略は、国際研究ではほとんど報告されていない、遺伝的に非常に多様な集団における生殖細胞系列および体細胞のNEN関連欠陥の状況を明らかにするでしょう。 この結果は、NEN における症候群の発現、腫瘍の挙動、および遺伝パターンを形成する既知のドライバー遺伝子の内外の変化をより深く理解するために、他の集団からのデータと比較される予定です。