Neuroendokriinisten kasvainten geneettiset perusteet meksikolaisilla potilailla

Johdanto.

NEN:t ovat heterogeeninen ryhmä ihmisen kasvaimia, joilla on vaihteleva kliininen käyttäytyminen, joka ulottuu laiskuudesta suoraan aggressiivisuuteen ja pahanlaatuisuuteen. Ne syntyvät erilaisista kudoksista, joilla on yhteinen alkioalkuperä ja joilla on yhteinen kyky tuottaa hormoneja. Niiden kasvu saattaa vaarantaa ympäröiviä rakenteita, ja ne aiheuttavat usein merkittävää sairastuvuutta niihin liittyvien hormonien liikaerityksen oireyhtymien vuoksi. Vaikka NEN:ien esiintymistiheys on perinteisesti pidetty harvinaisena, se on lisääntynyt huomattavasti viime vuosikymmeninä parantuneen kliinisen tietoisuuden ja diagnostisten strategioiden ansiosta. Tähän ryhmään kuuluvat leesiot, kuten bronkopulmonaaliset, maha-suolikanavan, haiman ja kateenkorvan NEN:t, medullaariset kilpirauhaskarsinoomat (MTC), paraganglioomat ja feokromosytoomat (PPGL:t), lisäkilpirauhasen adenoomat ja karsinoomat sekä aivolisäkkeen neuroendokriiniset kasvaimet (PitNET).

Mielenkiintoista on, että NEN:t kuuluvat ihmisen kasvaimiin, joilla on vahvin perinnöllinen komponentti. Jotkut NEN:t ovat osa moninkertaisen endokriinisen neoplasian autosomaalisia hallitsevia oireyhtymiä, joissa ne esiintyvät yhdessä muiden tyypillisten endokriinisten ja ei-endokriinisten kasvainten kanssa samassa yksilössä ja/tai perheessä. Tällaisten entiteettien kliinisiä kuvauksia on kirjallisuudessa 1900-luvun puolivälistä lähtien, vaikka niiden geneettiset syyt määritettiin vasta kolme tai neljä vuosikymmentä sitten. Muissa tapauksissa yhden tyyppinen kasvain, kuten MTC, PitNET tai PPGL, syntyy useissa saman perheen jäsenissä ilman muita siihen liittyviä ominaisuuksia. Toisinaan yksilöt, joilla on ilmeisen satunnainen esiintyminen, ovat todellakin yksinkertaisia ​​​​tapauksia perheolosuhteista. Tällä hetkellä tiedetään, että noin 50 % MTC-tapauksista, 40 % PPGL:istä, 20 % maha-suolikanavan, haiman, bronkopulmonaarisen ja kateenkorvan NEN-tapauksista, 15 % lisäkilpirauhasen NEN-tapauksista ja 5-10 % PitNET-tapauksista johtuvat ituradan vioista. Perinnöllisten geneettisten vikojen lisäksi somaattisen tason muutokset määräävät sekä satunnaisten että familiaalisten NEN:ien erityiset kliiniset kulkut.

Viimeisen vuosikymmenen aikana tehokkaiden työkalujen laaja käyttö geneettisiin analyyseihin on johtanut NEN:ien tunnettujen geneettisten syiden dramaattiseen lisääntymiseen. Nämä lähestymistavat ovat myös tuottaneet aiemmin epäiltyjä genotyyppi-fenotyyppi-assosiaatioita ja paljastaneet suuren päällekkäisyyden useiden endokriinisten neoplasioiden eri oireyhtymien kliinisissä esityksissä. Geenitestit ovat avainasemassa varhaisessa diagnoosissa, räätälöidyssä kliinisessä hoidossa ja geneettisessä neuvonnassa. Lisäksi kasvainten geneettiset analyysit ovat paljastaneet mahdollisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita. Geneettisen diagnoosin alustat eivät kuitenkaan ole laajasti saatavilla, ja tiedot geneettisten sairauksien aiheuttajista eivät edusta tarkasti kaikkia ihmispopulaatioita. Geneettisiä testejä ei ole laajalti saatavilla Meksikossa, ja niitä ei ole lähes ollenkaan sen julkisissa sairaaloissa, jotka palvelevat suurinta osaa maan noin 128 miljoonasta väestöstä. Mielenkiintoista on, että mestizot, jotka muodostavat suurimman osan Meksikon väestöstä, ovat yksi geneettisesti monimuotoisimmista ihmisryhmistä. Tarkkuuslääketieteen strategiat vaativat populaatiokohtaista tietoa, mutta meksikolaiset mestitsot ovat heikosti edustettuina kansainvälisissä geneettisissä tietokannoissa.

Tavoitteet.

Tarkan, vankan ja edullisen testausalustan avulla tämä projekti kuvaa NEN-solujen ituradan ja somaattisten geneettisten syiden repertuaaria ja esiintymistiheyttä suuressa mahdollisessa Meksikon mestizojen kohortissa. Siinä määritellään myös tiettyihin geneettisiin vaurioihin liittyvät fenotyypit ja kliiniset tulokset ja tutkitaan uusien vikojen toiminnallisia seurauksia geeneissä, jotka on aiemmin liitetty näihin kasvaimiin. Lopuksi se paljastaa ja luonnehtii perusteellisesti uusia geneettisiä assosiaatioita, mukaan lukien potentiaaliset lääkekohteet.

menetelmät.

Tutkimuksen hyväksyntä on saatu kahden vertailusairaalan instituutioiden arviointilautakunnilta: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projekti 4090) ja Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI (Instituto Mexicano del Seguro Social). IMSS, projekti R-2022-785-011). Tietoisella suostumuksella otetaan DNA-näytteet verestä ja tuoreista tai formaliinilla kiinnitetyistä ja parafiiniin upotetuista kasvaimista. Kaikki kokeelliset menetelmät exome-sekvensointia lukuun ottamatta suoritetaan Universidad Nacional Autónoma de Méxicon ja INCMNSZ:n tutkimustukiverkostossa. Tutkimus alkoi elokuussa 2022, ja se on suunniteltu 15 vuoden potentiaaliseksi kohortiksi, jossa on arviolta 750 osallistujaa. Aikuiset henkilöt (ikä ≥ 18 vuotta rekrytointihetkellä), joilla on uusi tai aiemmin diagnosoitu minkä tahansa tyyppinen NEN, kutsutaan osallistumaan, mukaan lukien satunnaiset, suvulliset, yksittäiset ja oireyhtymät. Kaikille osallistujille tarjotaan mahdollisuus saada geenitutkimusten tulokset. Ainutlaatuista tunnistamatonta koodia käytetään merkitsemään kaikki näytteet ja jokaisesta osallistujasta kerätyt tiedot heidän henkilötietojensa suojaamiseksi.

Yksityiskohdat sukuhistoriasta, kliinisestä esityksestä, biokemiallisista, kuvantamis-, histopatologisista ja aiemmista geneettisistä tutkimuksista kunkin osallistujan osalta syötetään tunnistamattomaan sähköiseen kliiniseen tietokantaan. Tietoja kliinisistä tuloksista kerätään prospektiivisesti enintään 15 vuoden ajalta. Kaikissa tapauksissa kerätään 5 ml:n perifeerinen verinäyte EDTA-putkeen värväyksen yhteydessä ja säilytetään 4 °C:ssa käsittelyyn asti. DNA uutetaan verinäytteistä 24 tunnin kuluessa keräämisestä. Potilailta, joilla on aiempi kasvainresektio, otetaan arkistoidut formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytteet, jos niitä on saatavilla. Jos mahdollista ja häiritsemättä rutiininomaisia ​​histopatologisia analyysejä, tuoreita pakastettuja kudosnäytteitä otetaan yksilöiltä, ​​joille tehdään kirurginen kasvainleikkaus tutkimuksen aikana. Pakastetut kudokset säilytetään nestetypessä käsittelyyn asti. DNA uutetaan kaikista kudosnäytteistä ja RNA erotetaan verestä tai kudosnäytteistä valituissa tapauksissa. Näytteen laatu ja pitoisuus analysoidaan spektrofotometrialla ja fluorometrialla. DNA säilytetään -20 °C:ssa ja RNA:ta -80 °C:ssa tutkimuksen ajan.

DNA-näytteet analysoidaan käyttämällä useita tekniikoita, jotka koostuvat ensimmäisen vaiheen kohdennetusta seuraavan sukupolven sekvensoinnista (NGS), jota seuraa kohdistettu array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) ja eksomisekvensointi (ES). NGS:ää varten on suunniteltu Twist Biosciences -alustaa käyttäen räätälöity paneeli, joka sisältää 54 geeniä, joilla on tunnettu yhteys NEN:ien kanssa. Kirjastot kaikkien osallistujien veren DNA:sta ja mahdollisuuksien mukaan tuoreesta kasvain-DNA:sta valmistetaan valmistajan ohjeiden mukaisesti ja sekvensoidaan Illumina MiSeq -laitteella noin 300x syvyydessä. Sekvenssit kartoitetaan GRCh38/hg38-ihmisen genomiin, PCR-kaksoiskappaleet merkitään ja varianttien kutsuminen suoritetaan yksittäisille nukleotidivarianteille (SNV), indeleille ja kopionumerovarianteille. Variantit valitaan niiden esiintymistiheyden perusteella (<0,1 % sekä yleisväestössä että Meksikon väestötietokannassa), ClinVarissa raportoitujen aikaisempien luokittelujen (American College of Medical Genetics and Genomicsin ja Association for Molecular Pathology -ohjeiden mukaan) sekä useiden eri tutkimustulosten perusteella. silico-ennustustyökalut ja kirjallisuus hakevat lisää kliinisiä ja kokeellisia tietoja.

Valituille tapauksille, jotka jäävät ilman geneettistä diagnoosia NGS-paneelin jälkeen, suoritetaan CNV-analyysi samoista kohdealueista. Tätä tarkoitusta varten on suunniteltu Agilent SureDesign -alustaa käyttäen korkeatiheyksinen aCGH, joka on kohdistettu samoille kiinnostaville alueille kuin NGS-paneeli. Näytteet käsitellään 16 x 25 K array-muodossa ja tulokset analysoidaan Agilent Genomic Workbench -ohjelmistolla. Varianttien suodatus ja luokittelu suoritetaan samalla tavalla kuin SNV:ille ja indeleille on kuvattu.

Kaikille asiaankuuluville patogeenisiksi ja todennäköisiksi patogeenisiksi luokitelluille varianteille tehdään ortogonaalinen validointi (Sangerin sekvensointi SNV:ille ja indeleille ja pisaradigitaalipolymeraasiketjureaktio CNV:ille). Kaikki osallistujat, jotka haluavat tietää tulokset, saavat yksityiskohtaiset raportit, jotka sisältävät kaikki asiaankuuluvat epävarman merkityksen variantit (VUS) sekä todennäköiset patogeeniset ja patogeeniset variantit sekä tulkinnan niiden kliinisestä merkityksestä. Kun kliininen aihe on aiheellinen, osallistujille tarjotaan lisäperheenjäsenten kohdennettua seulontaa. Valituille VUS:ille, mukaan lukien muunnokset, joita ei ole aiemmin raportoitu, suoritetaan lisäarviointi, mukaan lukien heterotsygoottisuuden häviämisen etsiminen kasvainkudoksissa, ilmentymismääritykset, koodaavan DNA:n sekvensointi ja/tai katkaisupisteanalyysit veressä ja/tai kasvainkudoksissa tai kokeellinen toiminnallinen validointi.

Geneettiset tulokset korreloidaan kliinisten tietojen kanssa tutkimuspopulaation kuhunkin fenotyyppiin liittyvien geneettisten vikojen esiintymistiheyden ja tyypin määrittämiseksi. Sitä vastoin saadaan perusteelliset kliiniset kuvaukset fenotyyppien valikoimasta, jotka liittyvät kuhunkin tiettyyn geneettiseen vikaan. Lisäksi tutkitaan tiettyjen genotyyppi-fenotyyppi-assosiaatioiden vaikutusta kliiniseen esitykseen ja kliinisiin tuloksiin. Tapaukset, joissa ei ole geneettistä diagnoosia kohdennetun NGS:n ja aCGH:n jälkeen, altistetaan eksomisekvensoinnille. Potilasryhmiä, joilla on samanlaiset fenotyypit, analysoidaan yhdessä tautikohtaisten vikojen tunnistamiseksi geeneissä, joita ei ole aiemmin liitetty NEN:iin. Uudet ehdokasyhdistykset karakterisoidaan perusteellisesti käyttämällä räätälöityjä kokeellisten lähestymistapojen yhdistelmiä sekä lisäseulontaa sairastuneissa perheissä.

Odotetut tulokset.

Useiden NEN-fenotyyppien sisällyttäminen ehdotettuun uuteen yleisen genotyypityksen alustaan ​​parantaa merkittävästi varianttien havaitsemisen todennäköisyyttä verrattuna tällä hetkellä saatavilla oleviin geneettisiin testeihin. Sen lisäksi, että tämä projekti tuottaa suuren määrän geneettistä ja kliinistä dataa tutkimuspopulaatiossa aiemmin tutkimattomista fenotyypeistä, se tulee hyvin todennäköisesti myös tunnistamaan uusia sairauden modifioijia ja perustajavariantteja. Nämä tiedot auttavat kehittämään populaatio- ja genotyyppispesifisiä strategioita geneettistä neuvontaa, varhaista diagnoosia, kliinistä seurantaa ja hoitoa varten, mikä parantaa NEN-potilaiden tulevia tuloksia. Tämä strategia paljastaa ituradan ja somaattisten NEN-vikojen maiseman geneettisesti erittäin monimuotoisessa populaatiossa, joka on huonosti edustettuna kansainvälisissä tutkimuksissa. Tuloksia verrataan muiden populaatioiden tietoihin, jotta voidaan ymmärtää paremmin tunnetuissa kuljettajageeneissä ja niiden ulkopuolella tapahtuvia muutoksia, jotka muokkaavat oireyhtymää, kasvainten käyttäytymistä ja perinnöllisyysmalleja NEN-soluissa.