Genetiske baser af neuroendokrine neoplasmer hos mexicanske patienter

Introduktion.

NEN'er er en heterogen gruppe af humane neoplasmer med en variabel klinisk adfærd, der spænder fra indolens til ærlig aggressivitet og malignitet. De opstår fra forskellige væv med fælles embryologisk oprindelse, der deler kapaciteten til at producere hormoner. Deres vækst kan kompromittere omgivende strukturer, og de forårsager ofte betydelig sygelighed på grund af deres associerede syndromer af hormonoversekretion. Selvom det traditionelt betragtes som sjældne, er frekvensen af ​​NEN'er steget markant i de sidste årtier på grund af forbedret klinisk bevidsthed og diagnostiske strategier. Denne gruppe omfatter læsioner såsom bronchopulmonale, gastrointestinale, pancreas og thymus NEN'er, medullært thyreoideacarcinom (MTC), paragangliomer og pheochromocytomas (PPGL'er), parathyroid adenomer og carcinomer og hypofyse neuroendokrine tumorer (PitNETs), blandt andre.

Interessant nok er NEN'er blandt de humane neoplasmer med en stærkest arvelig komponent. Nogle NEN'er er en del af autosomale dominante syndromer af multipel endokrin neoplasi, hvor de forekommer i kombination med andre karakteristiske endokrine og ikke-endokrine tumorer i samme individ og/eller familie. Kliniske beskrivelser af sådanne enheder eksisterer i litteraturen siden midten af ​​det tyvende århundrede, selvom deres genetiske årsager ikke blev bestemt før for tre eller fire årtier siden. I andre tilfælde opstår en enkelt type tumor, såsom MTC, PitNETs eller PPGL'er, i flere medlemmer af den samme familie uden andre tilknyttede funktioner. Nogle gange er individer med tilsyneladende sporadisk præsentation faktisk simpleks tilfælde af familiære forhold. Det er i øjeblikket kendt, at omkring 50% af tilfældene af MTC, 40% af PPGL'er, 20% af gastrointestinale, bugspytkirtel-, bronkopulmonale og thymus-NEN'er, 15% af parathyroid-NEN'er og 5-10% af PitNET'er skyldes kimlinjedefekter. Bortset fra arvelige genetiske defekter bestemmer ændringer på det somatiske niveau specifikke kliniske forløb i både sporadiske og familiære NEN'er.

I det sidste årti har den udbredte brug af kraftfulde værktøjer til genetiske analyser resulteret i en dramatisk stigning i de kendte genetiske årsager til NEN'er. Disse tilgange har også givet tidligere uanede genotype-fænotype-associationer og har afsløret et stort overlap i den kliniske præsentation af forskellige syndromer af multipel endokrin neoplasi. Genetiske test er nøglen til tidlig diagnose, skræddersyet klinisk ledelse og genetisk rådgivning. Desuden har genetiske analyser på tumorerne afdækket potentielle biomarkører og terapeutiske mål. Alligevel er platforme til genetisk diagnose ikke bredt tilgængelige, og data om genetiske sygdomsdrivere repræsenterer ikke nøjagtigt alle menneskelige populationer. Genetiske test er ikke almindeligt tilgængelige i Mexico og er næsten ikke-eksisterende på dets offentlige hospitaler, som betjener størstedelen af ​​landets ~128 millioner befolkning. Interessant nok er Mestizos, som tegner sig for det meste af den mexicanske befolkning, en af ​​de mest genetisk forskellige menneskelige grupper. Præcisionsmedicinstrategier kræver befolkningsspecifik information, men alligevel er mexicanske mestiser dårligt repræsenteret i internationale genetiske databaser.

Mål.

Ved at bruge en præcis, robust og overkommelig testplatform vil dette projekt beskrive repertoiret og hyppigheden af ​​kimlinie og somatiske genetiske årsager til NEN'er i en stor fremtidig kohorte af mexicanske mestiser. Det vil også definere fænotyper og kliniske resultater forbundet med specifikke genetiske defekter og udforske de funktionelle konsekvenser af nye defekter i gener, der tidligere var forbundet med disse neoplasmer. Endelig vil den afdække og grundigt karakterisere nye genetiske associationer, herunder potentielle lægelige mål.

Metoder.

Godkendelse til undersøgelsen er opnået fra Institutional Review Boards på to referencehospitaler: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projekt 4090) og Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, projekt R-2022-785-011). Under informeret samtykke vil der blive indhentet DNA-prøver fra blod og friske eller formalinfikserede og paraffinindlejrede tumorer. Alle eksperimentelle metoder, undtagen exome-sekventering, vil blive udført på Research Support Network for Universidad Nacional Autónoma de México og INCMNSZ. Undersøgelsen startede i august 2022 og er designet som en 15-årig prospektiv kohorte med anslået i alt 750 deltagere. Voksne personer (alder ≥18 år ved rekruttering) med ny eller tidligere diagnose af enhver type NEN vil blive inviteret til at deltage, herunder sporadiske, familiære, isolerede og syndromiske præsentationer. Alle deltagere vil blive tilbudt muligheden for at få resultaterne af deres genetiske undersøgelser. En unik afidentificeret kode vil blive brugt til at mærke alle prøver og data indsamlet for hver deltager for at beskytte deres personlige oplysninger.

Detaljer om familiehistorie, klinisk præsentation, biokemiske, billeddiagnostiske, histopatologiske og tidligere genetiske undersøgelser for hver deltager vil blive indtastet i en afidentificeret elektronisk klinisk database. Data om kliniske resultater vil blive indsamlet prospektivt i maksimalt 15 år. I alle tilfælde vil en 5 ml perifer blodprøve blive opsamlet i et rør med EDTA ved rekruttering og opbevaret ved 4°C indtil behandling. DNA vil blive ekstraheret fra blodprøver inden for 24 timer efter indsamling. Arkiverede formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver vil blive udtaget til patienter med tidligere tumorresektion, når de er tilgængelige. Når det er muligt og uden at interferere med rutinemæssige histopatologiske analyser, vil friske frosne vævsprøver blive udtaget fra individer, der gennemgår kirurgisk tumorudskæring i løbet af undersøgelsen. Frosne væv vil blive opbevaret i flydende nitrogen indtil behandling. DNA vil blive ekstraheret fra alle vævsprøver, og RNA vil blive ekstraheret fra blod eller vævsprøver i udvalgte tilfælde. Prøvekvalitet og koncentration vil blive analyseret ved spektrofotometri og fluorometri. DNA vil blive opbevaret ved -20 °C og RNA vil blive opbevaret ved -80 °C i hele undersøgelsens varighed.

DNA-prøver vil blive analyseret ved hjælp af flere teknikker, bestående af et første trin af målrettet næste generations sekventering (NGS), efterfulgt af målrettet array-baseret komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og exome sekventering (ES). Til NGS er der designet et tilpasset panel med 54 gener med en kendt association med NEN'er ved hjælp af Twist Biosciences-platformen. Biblioteker fra blod-DNA fra alle deltagere og, når det er muligt, frisk tumor-DNA, vil blive forberedt i henhold til producentens instruktioner og sekventeret i et Illumina MiSeq-instrument i en omtrentlig dybde på 300x. Sekvenser vil blive kortlagt til det humane GRCh38/hg38-genom, PCR-duplikater vil blive markeret, og variantkald vil blive udført for enkeltnukleotidvarianter (SNV'er), indels- og kopinummervarianter. Varianter vil blive udvalgt baseret på deres hyppighed (<0,1 % i både generel befolkning og mexicanske befolkningsdatabaser), tidligere klassificering (i henhold til American College of Medical Genetics and Genomics og Association for Molecular Pathology guidelines) rapporteret i ClinVar, resultater fra flere i silico forudsigelsesværktøjer og litteratursøgning efter yderligere kliniske og eksperimentelle data.

For udvalgte tilfælde, der forbliver uden genetisk diagnose efter NGS-panelet, vil der blive udført CNV-analyse af de samme målområder. Til dette formål er en højdensitets-aCGH målrettet mod de samme områder af interesse end NGS-panelet blevet designet ved hjælp af Agilent SureDesign-platformen. Prøver vil blive behandlet i et 16 x 25 K array-format, og resultaterne vil blive analyseret med Agilent Genomic Workbench-softwaren. Variantfiltrering og klassificering vil blive udført på samme måde som beskrevet for SNV'er og indels.

Alle relevante varianter klassificeret som patogene og sandsynligt patogene vil blive udsat for ortogonal validering (Sanger-sekventering for SNV'er og indels og dråbereaktion for digital polymerasekædereaktion for CNV'er). Alle deltagere, der vælger at kende deres resultater, vil modtage detaljerede rapporter, herunder alle relevante varianter af usikker signifikans (VUS), samt sandsynlige patogene og patogene varianter med en fortolkning af deres kliniske betydning. Når det er klinisk indiceret, vil deltagerne blive tilbudt kaskademålrettet screening af yderligere familiemedlemmer. Udvalgte VUS, inklusive varianter, der ikke tidligere er rapporteret, vil blive udsat for yderligere evalueringer, herunder søgning efter tab af heterozygositet i tumorvæv, ekspressionsassays, kodende DNA-sekventering og/eller breakpoint-analyser i blod og/eller tumorvæv eller eksperimentel funktionel validering.

De genetiske resultater vil blive korreleret med de kliniske data for at bestemme hyppigheden og typen af ​​genetiske defekter forbundet med hver fænotype i undersøgelsespopulationen. Omvendt vil der blive opnået grundige kliniske beskrivelser af repertoiret af fænotyper forbundet med hver specifik genetisk defekt. Indflydelsen af ​​særlige genotype-fænotype-associationer på den kliniske præsentation og kliniske resultater vil også blive undersøgt. Tilfælde uden genetisk diagnose efter målrettet NGS og aCGH vil blive udsat for exome-sekventering. Grupper af patienter med lignende fænotyper vil blive analyseret sammen for at identificere sygdomsspecifikke defekter i gener, der ikke tidligere er forbundet med NEN'er. Nye kandidatforeninger vil blive grundigt karakteriseret ved hjælp af specialdesignede kombinationer af eksperimentelle tilgange plus yderligere screening i berørte familier.

Forventede resultater.

Inkorporering af flere fænotyper af NEN'er i den foreslåede nye platform til generel genotypebestemmelse vil signifikant forbedre sandsynligheden for variantdetektion sammenlignet med de aktuelt tilgængelige genetiske tests. Udover at generere en stor mængde genetiske og kliniske data for tidligere uudforskede fænotyper i undersøgelsespopulationen, vil dette projekt højst sandsynligt også identificere nye sygdomsmodifikatorer og grundlæggervarianter. Disse data vil bidrage til udviklingen af ​​befolknings- og genotypespecifikke strategier for genetisk rådgivning, tidlig diagnose, klinisk opfølgning og behandling, og derved forbedre de fremtidige resultater for personer med NEN'er. Denne strategi vil afdække landskabet af kimlinie og somatiske NEN-associerede defekter i en ekstremt genetisk mangfoldig population, der er dårligt repræsenteret i internationale undersøgelser. Resultaterne vil blive sammenlignet med data fra andre populationer for bedre at forstå ændringerne inden for og uden for kendte drivergener, der former syndromiske præsentationer, tumoradfærd og arvemønstre i NEN'er.