Genetische basen van neuro-endocriene neoplasmata bij Mexicaanse patiënten

Invoering.

NEN's vormen een heterogene groep menselijke neoplasmata met een variabel klinisch gedrag, variërend van indolentie tot openhartige agressiviteit en kwaadaardigheid. Ze komen voort uit verschillende weefsels met een gemeenschappelijke embryologische oorsprong die het vermogen delen om hormonen te produceren. Hun groei kan omliggende structuren in gevaar brengen en ze veroorzaken vaak aanzienlijke morbiditeit als gevolg van de daarmee samenhangende syndromen van overmatige hormoonuitscheiding. Hoewel traditioneel als zeldzaam beschouwd, is de frequentie van NEN de afgelopen decennia sterk toegenomen als gevolg van een verbeterd klinisch bewustzijn en diagnostische strategieën. Deze groep omvat onder meer laesies zoals bronchopulmonale, gastro-intestinale, pancreas- en thymus-NEN's, medullair schildkliercarcinoom (MTC), paragangliomen en feochromocytomen (PPGL's), bijschildklieradenomen en -carcinomen, en neuro-endocriene tumoren van de hypofyse (PitNETs).

Interessant genoeg behoren NEN's tot de menselijke neoplasmata met een sterkste erfelijke component. Sommige NEN's maken deel uit van autosomaal dominante syndromen van multipele endocriene neoplasie, waarbij ze voorkomen in combinatie met andere karakteristieke endocriene en niet-endocriene tumoren in hetzelfde individu en/of dezelfde familie. Klinische beschrijvingen van dergelijke entiteiten bestaan ​​in de literatuur sinds het midden van de twintigste eeuw, hoewel hun genetische oorzaken pas drie tot vier decennia geleden werden vastgesteld. In andere gevallen ontstaat één type tumor, zoals MTC, PitNETs of PPGLs, in meerdere leden van dezelfde familie, zonder andere bijbehorende kenmerken. Af en toe zijn individuen met een ogenschijnlijk sporadische presentatie inderdaad simplex gevallen van familiale aandoeningen. Het is momenteel bekend dat ongeveer 50% van de gevallen van MTC, 40% van de PPGL's, 20% van de gastro-intestinale, pancreas-, bronchopulmonale en thymus-NEN's, 15% van de bijschildklier-NEN's en 5-10% van de PitNET's te wijten zijn aan kiembaandefecten. Naast erfelijke genetische defecten bepalen veranderingen op somatisch niveau het specifieke klinische beloop bij zowel sporadische als familiale NEN's.

In het afgelopen decennium heeft het wijdverbreide gebruik van krachtige hulpmiddelen voor genetische analyses geresulteerd in een dramatische toename van de bekende genetische oorzaken van NEN's. Deze benaderingen hebben ook voorheen onvermoede genotype-fenotype-associaties opgeleverd en een grote overlap blootgelegd in de klinische presentatie van verschillende syndromen van meervoudige endocriene neoplasie. Genetische tests zijn van cruciaal belang voor een vroege diagnose, klinisch management op maat en genetische counseling. Bovendien hebben genetische analyses van de tumoren potentiële biomarkers en therapeutische doelen blootgelegd. Toch zijn platforms voor genetische diagnose niet algemeen beschikbaar en geven gegevens over genetische ziekteveroorzakers niet nauwkeurig alle menselijke populaties weer. Genetische tests zijn niet overal verkrijgbaar in Mexico en zijn vrijwel onbestaande in de openbare ziekenhuizen, die de meerderheid van de ongeveer 128 miljoen inwoners van het land bedienen. Interessant is dat mestiezen, die het grootste deel van de Mexicaanse bevolking uitmaken, een van de genetisch meest diverse menselijke groepen zijn. Strategieën voor precisiegeneeskunde vereisen populatiespecifieke informatie, maar Mexicaanse mestiezen zijn slecht vertegenwoordigd in internationale genetische databases.

Doelstellingen.

Met behulp van een nauwkeurig, robuust en betaalbaar testplatform zal dit project het repertoire en de frequentie van kiemlijn- en somatisch genetische oorzaken van NEN's in een groot prospectief cohort van Mexicaanse mestiezen beschrijven. Het zal ook de fenotypes en klinische resultaten definiëren die verband houden met specifieke genetische defecten en de functionele gevolgen onderzoeken van nieuwe defecten in genen die eerder met deze neoplasmata geassocieerd waren. Ten slotte zal het nieuwe genetische associaties blootleggen en grondig karakteriseren, inclusief potentiële medicijnbare doelwitten.

Methoden.

Goedkeuring voor het onderzoek is verkregen van de Institutional Review Boards van twee referentieziekenhuizen: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, project 4090) en Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, project R-2022-785-011). Met geïnformeerde toestemming zullen DNA-monsters worden verkregen uit bloed en verse of in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde tumoren. Alle experimentele methoden, behalve exome-sequencing, zullen worden uitgevoerd bij het Research Support Network van de Universidad Nacional Autónoma de México en INCMNSZ. De studie startte in augustus 2022 en is opgezet als een 15-jarig prospectief cohort met een geschat totaal van 750 deelnemers. Volwassen personen (leeftijd ≥18 jaar bij rekrutering) met een nieuwe of eerdere diagnose van welk type NEN dan ook zullen worden uitgenodigd om deel te nemen, inclusief sporadische, familiale, geïsoleerde en syndromale presentaties. Alle deelnemers krijgen de mogelijkheid om de resultaten van hun genetisch onderzoek te verkrijgen. Er zal een unieke, geanonimiseerde code worden gebruikt om alle monsters en gegevens die voor elke deelnemer zijn verzameld te labelen, om hun persoonlijke gegevens te beschermen.

Details over familiegeschiedenis, klinische presentatie, biochemische, beeldvormende, histopathologische en eerdere genetische onderzoeken voor elke deelnemer zullen worden ingevoerd in een niet-geïdentificeerde elektronische klinische database. Gegevens over klinische uitkomsten worden prospectief verzameld gedurende maximaal 15 jaar. In alle gevallen wordt bij rekrutering een perifeer bloedmonster van 5 ml afgenomen in een buisje met EDTA en tot verwerking bij 4°C bewaard. Uit bloedmonsters wordt binnen 24 uur na afname DNA gehaald. Er zullen archiefformaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters worden verkregen voor patiënten die eerder een tumorresectie hebben ondergaan, indien beschikbaar. Indien mogelijk en zonder de routinematige histopathologische analyses te verstoren, zullen vers ingevroren weefselmonsters worden verkregen van personen die in de loop van het onderzoek een chirurgische tumorexcisie ondergaan. Bevroren weefsels worden tot verwerking in vloeibare stikstof bewaard. DNA zal uit alle weefselmonsters worden geëxtraheerd en in geselecteerde gevallen zal RNA uit bloed- of weefselmonsters worden geëxtraheerd. Monsterkwaliteit en concentratie zullen worden geanalyseerd door middel van spectrofotometrie en fluorometrie. DNA wordt gedurende de duur van het onderzoek bij -20 °C bewaard en RNA bij -80 °C.

DNA-monsters zullen worden geanalyseerd met behulp van meerdere technieken, bestaande uit een eerste stap van gerichte next-generation sequencing (NGS), gevolgd door gerichte array-gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH) en exome sequencing (ES). Voor NGS is een op maat gemaakt panel ontworpen met 54 genen met een bekende associatie met NEN's, met behulp van het Twist Biosciences-platform. Bibliotheken van bloed-DNA van alle deelnemers en, indien mogelijk, vers tumor-DNA, zullen worden bereid volgens de instructies van de fabrikant en worden gesequenced in een Illumina MiSeq-instrument op een diepte van ongeveer 300x. Sequenties zullen in kaart worden gebracht op het GRCh38/hg38 menselijke genoom, PCR-duplicaten zullen worden gemarkeerd en variantaanroepen zullen worden uitgevoerd voor varianten met één nucleotide (SNV's), indels en kopienummervarianten. Varianten zullen worden geselecteerd op basis van hun frequentie (<0,1% in databases van zowel de algemene bevolking als de Mexicaanse bevolking), eerdere classificatie (volgens de richtlijnen van het American College of Medical Genetics and Genomics en Association for Molecular Pathology) gerapporteerd in ClinVar, resultaten van meerdere in silico-voorspellingsinstrumenten en literatuuronderzoek naar aanvullende klinische en experimentele gegevens.

Voor geselecteerde gevallen die na het NGS-panel zonder genetische diagnose blijven, zal CNV-analyse van dezelfde beoogde regio's worden uitgevoerd. Voor dit doel is een aCGH met hoge dichtheid ontworpen, gericht op dezelfde interessegebieden als het NGS-paneel, met behulp van het Agilent SureDesign-platform. Monsters zullen worden verwerkt in een array-formaat van 16 x 25 K en de resultaten zullen worden geanalyseerd met de Agilent Genomic Workbench-software. Het filteren en classificeren van varianten zal op dezelfde manier gebeuren als beschreven voor SNV's en indels.

Alle relevante varianten geclassificeerd als pathogeen en waarschijnlijk pathogeen zullen worden onderworpen aan orthogonale validatie (Sanger-sequencing voor SNV's en indels en druppel digitale polymerasekettingreactie voor CNV's). Alle deelnemers die ervoor kiezen hun resultaten te kennen, ontvangen gedetailleerde rapporten met alle relevante varianten van onzekere significantie (VUS), evenals waarschijnlijke pathogene en pathogene varianten met een interpretatie van hun klinische betekenis. Wanneer dit klinisch geïndiceerd is, krijgen de deelnemers een cascadegerichte screening van extra familieleden aangeboden. Geselecteerde VUS, inclusief varianten die niet eerder zijn gerapporteerd, zullen worden onderworpen aan aanvullende evaluaties, waaronder onderzoek naar verlies van heterozygositeit in tumorweefsels, expressietests, coderende DNA-sequencing en/of breekpuntanalyses in bloed en/of tumorweefsels, of experimentele functionele validatie.

De genetische resultaten zullen worden gecorreleerd met de klinische gegevens om de frequentie en het type genetische defecten te bepalen die verband houden met elk fenotype in de onderzoekspopulatie. Omgekeerd zullen grondige klinische beschrijvingen worden verkregen van het repertoire van fenotypes geassocieerd met elk specifiek genetisch defect. De invloed van bepaalde genotype-fenotype-associaties op de klinische presentatie en klinische uitkomsten zal ook worden onderzocht. Gevallen zonder genetische diagnose na gerichte NGS en aCGH zullen worden onderworpen aan exome-sequencing. Groepen patiënten met vergelijkbare fenotypes zullen samen worden geanalyseerd om ziektespecifieke defecten in genen te identificeren die niet eerder met NEN's waren geassocieerd. Nieuwe kandidaat-associaties zullen grondig worden gekarakteriseerd met behulp van op maat ontworpen combinaties van experimentele benaderingen plus aanvullende screening in getroffen gezinnen.

Verwachte resultaten.

Het opnemen van meerdere fenotypes van NEN's in het voorgestelde nieuwe platform voor algemene genotypering zal de waarschijnlijkheid van variantdetectie aanzienlijk verbeteren, vergeleken met de momenteel beschikbare genetische tests. Naast het genereren van een grote hoeveelheid genetische en klinische gegevens voor voorheen onontdekte fenotypes in de onderzoekspopulatie, zal dit project zeer waarschijnlijk ook nieuwe ziektemodificatoren en grondleggervarianten identificeren. Deze gegevens zullen bijdragen aan de ontwikkeling van populatie- en genotypespecifieke strategieën voor genetische counseling, vroege diagnose, klinische follow-up en behandeling, waardoor de toekomstige resultaten van individuen met NEN's worden verbeterd. Deze strategie zal het landschap van kiemlijn- en somatische NEN-geassocieerde defecten blootleggen in een extreem genetisch diverse populatie die slecht vertegenwoordigd is in internationale studies. De resultaten zullen worden vergeleken met gegevens uit andere populaties om de veranderingen binnen en buiten bekende driver-genen die syndromale presentaties, tumorgedrag en overervingspatronen in NEN's bepalen, beter te begrijpen.