Genetyczne podstawy nowotworów neuroendokrynnych u pacjentów meksykańskich

Wstęp.

NEN to heterogenna grupa ludzkich nowotworów o zmiennym zachowaniu klinicznym, od gnuśności po jawną agresywność i złośliwość. Powstają z różnych tkanek o wspólnym pochodzeniu embriologicznym, które mają wspólną zdolność do wytwarzania hormonów. Ich wzrost może naruszyć otaczające struktury i często powodują znaczną zachorowalność z powodu powiązanych z nimi zespołów nadmiernego wydzielania hormonów. Chociaż tradycyjnie uważa się je za rzadkie, częstość występowania NEN znacznie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci dzięki większej świadomości klinicznej i strategiom diagnostycznym. Do tej grupy zaliczają się między innymi takie zmiany, jak NEN oskrzelowo-płucne, żołądkowo-jelitowe, trzustkowe i grasicowe, rak rdzeniasty tarczycy (MTC), przyzwojaki i guzy chromochłonne (PPGL), gruczolaki i raki przytarczyc oraz guzy neuroendokrynne przysadki mózgowej (PitNET).

Co ciekawe, NEN należą do nowotworów człowieka o najsilniejszym składniku dziedzicznym. Niektóre NEN są częścią autosomalnie dominujących zespołów mnogiej neoplazji endokrynnej, które występują w połączeniu z innymi charakterystycznymi nowotworami endokrynnymi i nieendokrynnymi u tej samej osoby i/lub rodziny. Opisy kliniczne takich jednostek pojawiają się w literaturze od połowy XX wieku, choć ich przyczyny genetyczne ustalono dopiero trzy–cztery dekady temu. W innych przypadkach pojedynczy typ nowotworu, taki jak MTC, PitNET lub PPGL, pojawia się u wielu członków tej samej rodziny, bez innych powiązanych cech. Czasami osoby z pozornie sporadyczną prezentacją są w istocie jednostronnymi przypadkami chorób rodzinnych. Obecnie wiadomo, że około 50% przypadków MTC, 40% PPGL, 20% NEN przewodu pokarmowego, trzustki, oskrzeli i grasicy, 15% NEN przytarczyc i 5–10% PitNET wynika z wad linii zarodkowej. Oprócz dziedzicznych wad genetycznych, zmiany na poziomie somatycznym determinują specyficzny przebieg kliniczny zarówno w sporadycznych, jak i rodzinnych NEN.

W ostatniej dekadzie powszechne stosowanie potężnych narzędzi do analiz genetycznych spowodowało dramatyczny wzrost liczby znanych genetycznych przyczyn NEN. Podejścia te przyniosły również nieoczekiwane wcześniej powiązania genotyp-fenotyp i odkryły duże nakładanie się obrazu klinicznego różnych zespołów mnogiej neoplazji endokrynnej. Testy genetyczne mają kluczowe znaczenie dla wczesnej diagnozy, dostosowanego do indywidualnych potrzeb postępowania klinicznego i poradnictwa genetycznego. Co więcej, analizy genetyczne nowotworów pozwoliły odkryć potencjalne biomarkery i cele terapeutyczne. Jednak platformy diagnostyki genetycznej nie są powszechnie dostępne, a dane na temat czynników powodujących choroby genetyczne nie odzwierciedlają dokładnie wszystkich populacji ludzkich. Testy genetyczne nie są powszechnie dostępne w Meksyku i prawie nie istnieją w szpitalach publicznych, które obsługują większość około 128 milionów populacji kraju. Co ciekawe, Metysi, którzy stanowią większość populacji Meksyku, są jedną z najbardziej zróżnicowanych genetycznie grup ludzkich. Strategie medycyny precyzyjnej wymagają informacji specyficznych dla populacji, jednak meksykańscy Metysi są słabo reprezentowani w międzynarodowych bazach danych genetycznych.

Celuje.

Wykorzystując precyzyjną, solidną i niedrogą platformę testową, projekt ten opisuje repertuar i częstotliwość genetycznych przyczyn NEN w linii zarodkowej i somatycznej w dużej przyszłej kohorcie meksykańskich Metysów. Zdefiniowane zostaną także fenotypy i wyniki kliniczne związane z określonymi defektami genetycznymi oraz zbadane zostaną funkcjonalne konsekwencje nowych defektów w genach wcześniej powiązanych z tymi nowotworami. Wreszcie odkryje i dokładnie scharakteryzuje nowe powiązania genetyczne, w tym potencjalne cele nadające się do leczenia.

Metody.

Zgodę na badanie uzyskano od Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych dwóch szpitali referencyjnych: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projekt 4090) i Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social (INCMNSZ, projekt 4090) IMSS, projekt R-2022-785-011). Za świadomą zgodą zostaną pobrane próbki DNA z krwi oraz guzów świeżych lub utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Wszystkie metody eksperymentalne, z wyjątkiem sekwencjonowania egzomu, zostaną przeprowadzone w Sieci Wsparcia Badań Universidad Nacional Autónoma de México i INCMNSZ. Badanie rozpoczęło się w sierpniu 2022 r. i zostało zaprojektowane jako 15-letnia prospektywna kohorta, w której weźmie udział szacunkowo 750 uczestników. Do udziału zostaną zaproszone osoby dorosłe (w wieku ≥18 lat w chwili rekrutacji) z nową lub wcześniejszą diagnozą dowolnego typu NEN, w tym z objawami sporadczymi, rodzinnymi, izolowanymi i objawowymi. Wszyscy uczestnicy otrzymają możliwość uzyskania wyników swoich badań genetycznych. Do oznakowania wszystkich próbek i danych zebranych dla każdego uczestnika zostanie użyty unikalny, zdezidentyfikowany kod, aby chronić jego dane osobowe.

Szczegóły dotyczące historii rodziny, obrazu klinicznego, badań biochemicznych, obrazowych, histopatologicznych i wcześniejszych badań genetycznych każdego uczestnika zostaną wprowadzone do zdeidentyfikowanej elektronicznej bazy danych klinicznych. Dane dotyczące wyników klinicznych będą gromadzone prospektywnie przez maksymalnie 15 lat. We wszystkich przypadkach podczas rekrutacji zostanie pobrana próbka krwi obwodowej o objętości 5 ml do probówki z EDTA i przechowywana w temperaturze 4°C do czasu przetwarzania. DNA zostanie pobrane z próbek krwi w ciągu 24 godzin od pobrania. Archiwalne próbki tkanek utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE) zostaną pobrane od pacjentów po wcześniejszej resekcji guza, jeśli będą dostępne. Jeśli to możliwe i nie zakłóca to rutynowych analiz histopatologicznych, od osób poddawanych chirurgicznemu wycięciu guza w trakcie badania zostaną pobrane świeżo zamrożone próbki tkanek. Zamrożone tkanki będą przechowywane w ciekłym azocie do czasu przetworzenia. Ze wszystkich próbek tkanek zostanie pobrany DNA, a w wybranych przypadkach z próbek krwi lub tkanek RNA. Jakość i stężenie próbki będą analizowane za pomocą spektrofotometrii i fluorometrii. DNA będzie przechowywane w temperaturze -20°C, a RNA w temperaturze -80°C przez cały czas trwania badania.

Próbki DNA będą analizowane przy użyciu wielu technik, obejmujących pierwszy etap ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji (NGS), a następnie ukierunkowaną porównawczą hybrydyzację genomową opartą na macierzach (aCGH) i sekwencjonowanie egzomu (ES). Dla NGS zaprojektowano dostosowany panel zawierający 54 geny o znanym powiązaniu z NEN, przy użyciu platformy Twist Biosciences. Biblioteki DNA krwi wszystkich uczestników oraz, jeśli to możliwe, DNA świeżego nowotworu zostaną przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta i zsekwencjonowane w aparacie Illumina MiSeq na głębokości około 300x. Sekwencje zostaną zmapowane do ludzkiego genomu GRCh38/hg38, zostaną oznaczone duplikaty PCR i przeprowadzone zostanie wywołanie wariantów dla wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), indeli i wariantów liczby kopii. Warianty zostaną wybrane na podstawie ich częstotliwości (<0,1% zarówno w bazach danych populacji ogólnej, jak i populacji meksykańskiej), wcześniejszej klasyfikacji (zgodnie z wytycznymi American College of Medical Genetics and Genomics oraz Association for Molecular Pathology) zgłoszonej w ClinVar, wyników wielu narzędzia przewidywania silico oraz wyszukiwanie literatury w celu uzyskania dodatkowych danych klinicznych i eksperymentalnych.

W przypadku wybranych przypadków, które nie zostały poddane diagnostyce genetycznej po panelu NGS, przeprowadzona zostanie analiza CNV tych samych docelowych regionów. W tym celu zaprojektowano aCGH o dużej gęstości, ukierunkowany na te same obszary zainteresowania co panel NGS, przy użyciu platformy Agilent SureDesign. Próbki będą przetwarzane w formacie macierzy 16 x 25 K, a wyniki będą analizowane za pomocą oprogramowania Agilent Genomic Workbench. Filtrowanie i klasyfikacja wariantów zostaną przeprowadzone w podobny sposób, jak opisano dla wartości SNV i indeli.

Wszystkie istotne warianty sklasyfikowane jako patogenne i prawdopodobnie patogenne zostaną poddane walidacji ortogonalnej (sekwencjonowanie Sangera dla SNV i indeli oraz cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej dla CNV). Wszyscy uczestnicy, którzy zdecydują się poznać swoje wyniki, otrzymają szczegółowe raporty zawierające wszystkie istotne warianty o niepewnym znaczeniu (VUS), a także prawdopodobne patogenne i patogenne warianty z interpretacją ich znaczenia klinicznego. Jeśli będzie to klinicznie wskazane, uczestnikom zostanie zaproponowane kaskadowe ukierunkowane badanie przesiewowe dodatkowych członków rodziny. Wybrane VUS, w tym warianty wcześniej nie zgłaszane, zostaną poddane dodatkowym ocenom, w tym poszukiwaniu utraty heterozygotyczności w tkankach nowotworowych, testom ekspresji, sekwencjonowaniu kodującego DNA i/lub analizie punktów przerwania we krwi i/lub tkankach nowotworowych lub eksperymentalnej walidacji funkcjonalnej.

Wyniki genetyczne zostaną skorelowane z danymi klinicznymi, aby określić częstotliwość i rodzaj defektów genetycznych związanych z każdym fenotypem w badanej populacji. I odwrotnie, uzyskany zostanie dokładny opis kliniczny repertuaru fenotypów związanych z każdym konkretnym defektem genetycznym. Zbadany zostanie również wpływ poszczególnych powiązań genotyp-fenotyp na obraz kliniczny i wyniki kliniczne. Przypadki bez diagnozy genetycznej po ukierunkowanych NGS i aCGH zostaną poddane sekwencjonowaniu egzomu. Grupy pacjentów o podobnych fenotypach zostaną wspólnie przeanalizowane w celu zidentyfikowania specyficznych dla choroby defektów w genach, które nie były wcześniej kojarzone z NEN. Nowatorskie stowarzyszenia kandydatów zostaną dokładnie scharakteryzowane przy użyciu specjalnie zaprojektowanych kombinacji podejść eksperymentalnych i dodatkowych badań przesiewowych w rodzinach dotkniętych chorobą.

Oczekiwane rezultaty.

Włączenie wielu fenotypów NEN do proponowanej nowatorskiej platformy ogólnego genotypowania znacznie poprawi prawdopodobieństwo wykrycia wariantu w porównaniu z obecnie dostępnymi testami genetycznymi. Oprócz wygenerowania dużej ilości danych genetycznych i klinicznych na temat wcześniej niezbadanych fenotypów w badanej populacji, w ramach tego projektu najprawdopodobniej zostaną zidentyfikowane także nowe modyfikatory choroby i warianty założycielskie. Dane te przyczynią się do opracowania specyficznych dla populacji i genotypu strategii poradnictwa genetycznego, wczesnej diagnostyki, obserwacji klinicznej i leczenia, poprawiając w ten sposób przyszłe wyniki leczenia osób z NEN. Strategia ta odkryje krajobraz defektów linii zarodkowej i somatycznych związanych z NEN w niezwykle zróżnicowanej genetycznie populacji, która jest słabo reprezentowana w badaniach międzynarodowych. Wyniki zostaną porównane z danymi z innych populacji, aby lepiej zrozumieć zmiany w obrębie i poza znanymi genami kierującymi, które kształtują objawy chorobowe, zachowania nowotworów i wzorce dziedziczenia w NEN.