Genetiske baser for nevroendokrine neoplasmer hos meksikanske pasienter

Introduksjon.

NEN-er er en heterogen gruppe av humane neoplasmer med en variabel klinisk atferd, som spenner fra indolens til ærlig aggressivitet og malignitet. De oppstår fra ulike vev med felles embryologisk opprinnelse som deler kapasiteten til å produsere hormoner. Veksten deres kan kompromittere omkringliggende strukturer, og de forårsaker ofte betydelig sykelighet på grunn av deres tilknyttede syndromer med hormonoverutskillelse. Selv om det tradisjonelt anses som sjeldne, har frekvensen av NEN økt kraftig de siste tiårene, på grunn av forbedret klinisk bevissthet og diagnostiske strategier. Denne gruppen inkluderer lesjoner som bronkopulmonale, gastrointestinale, bukspyttkjertel- og tymiske NEN-er, medullært skjoldbruskkjertelkarsinom (MTC), paragangliomer og feokromocytomer (PPGL), parathyroidadenomer og karsinomer, og hypofyse-nevroendokrine svulster (PitNETs), blant andre.

Interessant nok er NEN-er blant de humane neoplasmene med en sterkest arvelig komponent. Noen NEN-er er en del av autosomalt dominante syndromer av multippel endokrin neoplasi, der de presenteres i kombinasjon med andre karakteristiske endokrine og ikke-endokrine svulster i samme individ og/eller familie. Kliniske beskrivelser av slike enheter eksisterer i litteraturen siden midten av det tjuende århundre, selv om deres genetiske årsaker ikke ble bestemt før for tre eller fire tiår siden. I andre tilfeller oppstår en enkelt type svulst, slik som MTC, PitNETs eller PPGLs, i flere medlemmer av samme familie, uten andre tilknyttede funksjoner. Noen ganger er individer med tilsynelatende sporadisk presentasjon faktisk simpleks tilfeller av familiære forhold. Det er for tiden kjent at rundt 50 % av tilfellene av MTC, 40 % av PPGL-er, 20 % av gastrointestinale, bukspyttkjertel-, bronkopulmonale og tymiske NEN-er, 15 % av parathyroid-NEN og 5-10 % av PitNET-er skyldes kimlinjedefekter. Bortsett fra arvelige genetiske defekter, bestemmer endringer på somatisk nivå spesifikke kliniske forløp i både sporadiske og familiære NEN-er.

I det siste tiåret har den utbredte bruken av kraftige verktøy for genetiske analyser resultert i en dramatisk økning i de kjente genetiske årsakene til NEN. Disse tilnærmingene har også gitt tidligere uventede genotype-fenotype assosiasjoner og har avdekket en stor overlapping i den kliniske presentasjonen av forskjellige syndromer av multippel endokrin neoplasi. Genetiske tester er nøkkelen for tidlig diagnose, skreddersydd klinisk behandling og genetisk rådgivning. Videre har genetiske analyser på svulstene avdekket potensielle biomarkører og terapeutiske mål. Likevel er plattformer for genetisk diagnose ikke allment tilgjengelige, og data om genetiske sykdomsdrivere representerer ikke nøyaktig alle menneskelige populasjoner. Genetiske tester er ikke allment tilgjengelige i Mexico og er nesten ikke-eksisterende i de offentlige sykehusene, som betjener flertallet av landets ~128 millioner innbyggere. Interessant nok er Mestizos, som utgjør det meste av den meksikanske befolkningen, en av de mest genetisk mangfoldige menneskegruppene. Presisjonsmedisinstrategier krever populasjonsspesifikk informasjon, men meksikanske mestiser er dårlig representert i internasjonale genetiske databaser.

Mål.

Ved å bruke en presis, robust og rimelig testplattform, vil dette prosjektet beskrive repertoaret og frekvensen av kimlinje og somatiske genetiske årsaker til NEN i en stor potensiell kohort av meksikanske mestiser. Den vil også definere fenotyper og kliniske utfall assosiert med spesifikke genetiske defekter og utforske de funksjonelle konsekvensene av nye defekter i gener som tidligere var assosiert med disse neoplasmene. Til slutt vil den avdekke og grundig karakterisere nye genetiske assosiasjoner, inkludert potensielle medisinerbare mål.

Metoder.

Godkjenning for studien er innhentet fra Institutional Review Boards ved to referansesykehus: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, prosjekt 4090), og Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, prosjekt R-2022-785-011). Under informert samtykke vil DNA-prøver fra blod og ferske eller formalinfikserte og parafininnstøpte svulster innhentes. Alle eksperimentelle metoder, unntatt exome-sekvensering, vil bli utført ved Research Support Network til Universidad Nacional Autónoma de México og INCMNSZ. Studien startet i august 2022 og er designet som en 15-årig prospektiv kohort med anslagsvis totalt 750 deltakere. Voksne personer (alder ≥18 år ved rekruttering) med ny eller tidligere diagnose av enhver type NEN vil bli invitert til å delta, inkludert sporadiske, familiære, isolerte og syndromiske presentasjoner. Alle deltakere vil bli tilbudt muligheten til å få resultatene av sine genetiske studier. En unik avidentifisert kode vil bli brukt til å merke alle prøver og data som samles inn for hver deltaker, for å beskytte deres personlige opplysninger.

Detaljer om familiehistorie, klinisk presentasjon, biokjemiske, bildediagnostiske, histopatologiske og tidligere genetiske studier for hver deltaker vil bli lagt inn i en avidentifisert elektronisk klinisk database. Data om kliniske utfall vil bli samlet inn prospektivt i maksimalt 15 år. For alle tilfeller vil en 5 ml perifer blodprøve samles i et rør med EDTA ved rekruttering og lagres ved 4°C frem til behandling. DNA vil bli ekstrahert fra blodprøver innen 24 timer etter innsamling. Arkiverte formalinfikserte parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver vil bli innhentet for pasienter med tidligere tumorreseksjon, når tilgjengelig. Når det er mulig og uten å forstyrre rutinemessige histopatologiske analyser, vil ferske frosne vevsprøver bli innhentet fra individer som gjennomgår kirurgisk tumoreksisjon i løpet av studien. Frosset vev vil bli lagret i flytende nitrogen frem til behandling. DNA vil bli ekstrahert fra alle vevsprøver og RNA vil bli ekstrahert fra blod eller vevsprøver i utvalgte tilfeller. Prøvekvalitet og konsentrasjon vil bli analysert med spektrofotometri og fluorometri. DNA vil bli lagret ved -20 °C og RNA vil bli lagret ved -80 °C så lenge studien varer.

DNA-prøver vil bli analysert ved hjelp av flere teknikker, bestående av et første trinn med målrettet neste generasjons sekvensering (NGS), etterfulgt av målrettet array-basert komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og eksomsekvensering (ES). For NGS er det designet et tilpasset panel som inkluderer 54 gener med en kjent assosiasjon til NEN, ved å bruke Twist Biosciences-plattformen. Biblioteker fra blod-DNA fra alle deltakere og, når det er mulig, friskt tumor-DNA, vil bli klargjort i henhold til produsentens instruksjoner og sekvensert i et Illumina MiSeq-instrument på en omtrentlig dybde på 300x. Sekvenser vil bli kartlagt til det humane GRCh38/hg38-genomet, PCR-duplikater vil bli merket, og variantanrop vil bli utført for enkeltnukleotidvarianter (SNV), indels- og kopinummervarianter. Varianter vil bli valgt basert på deres frekvens (<0,1 % i både generell befolkning og meksikanske befolkningsdatabaser), tidligere klassifisering (i henhold til American College of Medical Genetics and Genomics og Association for Molecular Pathology guidelines) rapportert i ClinVar, resultater fra flere i silico prediksjonsverktøy og litteratursøk etter ytterligere kliniske og eksperimentelle data.

For utvalgte tilfeller som gjenstår uten genetisk diagnose etter NGS-panelet, vil CNV-analyse av de samme målregionene bli utført. For dette formålet er en høytetthets-aCGH rettet mot de samme interesseområdene enn NGS-panelet blitt designet ved å bruke Agilent SureDesign-plattformen. Prøver vil bli behandlet i et 16 x 25 K array-format og resultatene vil bli analysert med Agilent Genomic Workbench-programvaren. Variantfiltrering og klassifisering vil bli gjort på lignende måte som beskrevet for SNVer og indeler.

Alle relevante varianter klassifisert som patogene og sannsynlig patogene vil bli gjenstand for ortogonal validering (Sanger-sekvensering for SNV-er og indeler og dråpereaksjon med digital polymerase-kjedereaksjon for CNV-er). Alle deltakere som velger å vite resultatene vil motta detaljerte rapporter inkludert alle relevante varianter av usikker betydning (VUS), samt sannsynlige patogene og patogene varianter med en tolkning av deres kliniske betydning. Når det er klinisk indisert, vil deltakerne bli tilbudt kaskademålrettet screening av ytterligere familiemedlemmer. Utvalgte VUS, inkludert varianter som ikke tidligere er rapportert, vil bli gjenstand for ytterligere evalueringer, inkludert søk etter tap av heterozygositet i tumorvev, ekspresjonsanalyser, kodende DNA-sekvensering og/eller bruddpunktanalyser i blod og/eller tumorvev, eller eksperimentell funksjonell validering.

De genetiske resultatene vil bli korrelert med de kliniske dataene for å bestemme hyppigheten og typen av genetiske defekter knyttet til hver fenotype i studiepopulasjonen. Motsatt vil grundige kliniske beskrivelser av repertoaret av fenotyper assosiert med hver spesifikk genetisk defekt oppnås. Påvirkningen av spesielle genotype-fenotype assosiasjoner på den kliniske presentasjonen og kliniske utfall vil også bli utforsket. Tilfeller uten genetisk diagnose etter målrettet NGS og aCGH vil bli utsatt for exome-sekvensering. Grupper av pasienter med lignende fenotyper vil bli analysert sammen for å identifisere sykdomsspesifikke defekter i gener som ikke tidligere er assosiert med NEN. Nye kandidatforeninger vil bli grundig karakterisert ved å bruke spesialdesignede kombinasjoner av eksperimentelle tilnærminger pluss ytterligere screening i berørte familier.

Forventede resultater.

Innlemming av flere fenotyper av NEN-er i den foreslåtte nye plattformen for generell genotyping vil betydelig forbedre sannsynligheten for variantdeteksjon, sammenlignet med de for øyeblikket tilgjengelige genetiske testene. I tillegg til å generere en stor mengde genetiske og kliniske data for tidligere uutforskede fenotyper i studiepopulasjonen, vil dette prosjektet med stor sannsynlighet også identifisere nye sykdomsmodifikatorer og grunnleggervarianter. Disse dataene vil bidra til utviklingen av populasjons- og genotypespesifikke strategier for genetisk rådgivning, tidlig diagnose, klinisk oppfølging og behandling, og dermed forbedre de fremtidige resultatene for individer med NEN. Denne strategien vil avdekke landskapet av kimlinje og somatiske NEN-assosierte defekter i en ekstremt genetisk mangfoldig populasjon som er lite representert i internasjonale studier. Resultatene vil bli sammenlignet med data fra andre populasjoner for å bedre forstå endringene innenfor og utenfor kjente drivergener som former syndrompresentasjoner, tumoratferd og arvemønstre i NEN-er.