Genetické základy neuroendokrinních novotvarů u mexických pacientů

Úvod.

NEN jsou heterogenní skupinou lidských novotvarů s proměnlivým klinickým chováním, od indolence po upřímnou agresivitu a malignitu. Vznikají z různých tkání se společným embryologickým původem, které sdílejí schopnost produkovat hormony. Jejich růst může ohrozit okolní struktury a často způsobují významnou morbiditu v důsledku souvisejících syndromů nadměrné sekrece hormonů. Ačkoli jsou NEN tradičně považovány za vzácné, frekvence NEN se v posledních desetiletích výrazně zvýšila díky lepšímu klinickému povědomí a diagnostickým strategiím. Tato skupina zahrnuje mimo jiné léze, jako jsou bronchopulmonální, gastrointestinální, pankreatické a thymické NEN, medulární karcinom štítné žlázy (MTC), paragangliomy a feochromocytomy (PPGL), adenomy a karcinomy příštítných tělísek a neuroendokrinní nádory hypofýzy (PitNETs).

Zajímavé je, že NEN patří mezi lidské novotvary s nejsilnější dědičnou složkou. Některé NEN jsou součástí autozomálně dominantních syndromů mnohočetné endokrinní neoplazie, kde se vyskytují v kombinaci s dalšími charakteristickými endokrinními a neendokrinními nádory u stejného jedince a/nebo rodiny. Klinické popisy takových entit existují v literatuře od poloviny dvacátého století, ačkoli jejich genetické příčiny nebyly určeny až před třemi nebo čtyřmi desetiletími. V jiných případech se jeden typ nádoru, jako je MTC, PitNET nebo PPGL, objevuje u více členů stejné rodiny, bez dalších přidružených znaků. Občas jsou jedinci se zjevně sporadickou prezentací skutečně simplexními případy rodinných onemocnění. V současnosti je známo, že přibližně 50 % případů MTC, 40 % PPGL, 20 % gastrointestinálních, pankreatických, bronchopulmonálních a thymických NEN, 15 % příštítných tělísek a 5–10 % PitNET je způsobeno defekty zárodečné linie. Kromě dědičných genetických defektů určují změny na somatické úrovni specifické klinické průběhy jak u sporadických, tak u familiárních NEN.

V posledním desetiletí vedlo široké používání výkonných nástrojů pro genetické analýzy k dramatickému nárůstu známých genetických příčin NEN. Tyto přístupy také přinesly dříve netušené asociace genotyp-fenotyp a odhalily velké překrývání v klinické prezentaci různých syndromů mnohočetné endokrinní neoplazie. Genetické testy jsou klíčové pro včasnou diagnostiku, klinický management na míru a genetické poradenství. Navíc genetické analýzy nádorů odhalily potenciální biomarkery a terapeutické cíle. Platformy pro genetickou diagnostiku však nejsou široce dostupné a údaje o faktorech ovlivňujících genetická onemocnění nereprezentují přesně všechny lidské populace. Genetické testy nejsou v Mexiku široce dostupné a téměř neexistují v jeho veřejných nemocnicích, které slouží většině ∼128 milionů obyvatel země. Zajímavé je, že mestizové, kteří tvoří většinu mexické populace, jsou jednou z geneticky nejrozmanitějších lidských skupin. Strategie přesné medicíny vyžadují informace specifické pro populaci, přesto jsou mexičtí mesticové v mezinárodních genetických databázích zastoupeni jen málo.

Cíle.

Pomocí přesné, robustní a dostupné testovací platformy tento projekt popíše repertoár a frekvenci zárodečných a somatických genetických příčin NEN ve velké potenciální kohortě mexických mesticů. Bude také definovat fenotypy a klinické výsledky spojené se specifickými genetickými defekty a prozkoumat funkční důsledky nových defektů v genech dříve spojených s těmito novotvary. Nakonec odhalí a důkladně charakterizuje nové genetické asociace, včetně potenciálních cílů, které lze podat drogám.

Metody.

Schválení studie bylo získáno od Institutional Review Boards dvou referenčních nemocnic: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projekt 4090) a Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, projekt R-2022-785-011). Na základě informovaného souhlasu budou odebrány vzorky DNA z krve a čerstvých nádorů nebo nádorů fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Všechny experimentální metody, kromě sekvenování exomu, budou prováděny v síti podpory výzkumu na Universidad Nacional Autónoma de México a INCMNSZ. Studie začala v srpnu 2022 a je navržena jako 15letá prospektivní kohorta s odhadovaným celkovým počtem 750 účastníků. K účasti budou pozváni dospělí jedinci (věk ≥ 18 let při náboru) s novou nebo předchozí diagnózou jakéhokoli typu NEN, včetně sporadických, familiárních, izolovaných a syndromových projevů. Všem účastníkům bude nabídnuta možnost získat výsledky svých genetických studií. Jedinečný deidentifikovaný kód bude použit k označení všech vzorků a dat shromážděných pro každého účastníka, aby byly chráněny jeho osobní údaje.

Podrobnosti o rodinné anamnéze, klinickém zobrazení, biochemických, zobrazovacích, histopatologických a předchozích genetických studiích pro každého účastníka budou vloženy do neidentifikované elektronické klinické databáze. Údaje o klinických výsledcích budou shromažďovány prospektivně po dobu maximálně 15 let. Ve všech případech se při odběru odebere 5 ml vzorek periferní krve do zkumavky s EDTA a uloží se při 4 °C až do zpracování. DNA bude extrahována ze vzorků krve do 24 hodin po odběru. U pacientů s předchozí resekcí nádoru budou získány archivní vzorky tkáně fixované ve formalínu zalité v parafínu (FFPE), pokud budou k dispozici. Pokud je to možné a bez narušení rutinních histopatologických analýz, budou odebrány vzorky čerstvé zmrazené tkáně od jedinců, kteří podstoupili chirurgickou excizi nádoru v průběhu studie. Zmrazené tkáně budou až do zpracování skladovány v tekutém dusíku. DNA bude extrahována ze všech vzorků tkáně a RNA bude ve vybraných případech extrahována ze vzorků krve nebo tkání. Kvalita a koncentrace vzorků bude analyzována spektrofotometrií a fluorometrií. DNA bude uchovávána při -20 °C a RNA bude uchovávána při -80 °C po dobu trvání studie.

Vzorky DNA budou analyzovány pomocí různých technik, které se skládají z prvního kroku cíleného sekvenování nové generace (NGS), po kterém následuje cílená komparativní genomová hybridizace na bázi čipů (aCGH) a sekvenování exomů (ES). Pro NGS byl navržen přizpůsobený panel obsahující 54 genů se známou asociací s NEN s využitím platformy Twist Biosciences. Knihovny z krevní DNA všech účastníků a pokud je to možné i čerstvá nádorová DNA, budou připraveny podle pokynů výrobce a sekvenovány v přístroji Illumina MiSeq v hloubce přibližně 300x. Sekvence budou mapovány do lidského genomu GRCh38/hg38, budou označeny duplikáty PCR a bude provedeno volání variant pro jednonukleotidové varianty (SNV), indely a varianty s počtem kopií. Varianty budou vybrány na základě jejich frekvence (<0,1 % v databázích obecné populace i mexické populace), předchozí klasifikace (podle směrnic American College of Medical Genetics and Genomics and Association for Molecular Pathology) hlášené v ClinVar, výsledky z více v nástroje silico predikce a vyhledávání v literatuře pro další klinická a experimentální data.

U vybraných případů, které zůstaly bez genetické diagnózy po panelu NGS, bude provedena analýza CNV stejných cílových oblastí. Pro tento účel byl navržen aCGH s vysokou hustotou zacílený na stejné oblasti zájmu než panel NGS, pomocí platformy Agilent SureDesign. Vzorky budou zpracovány ve formátu pole 16 x 25 K a výsledky budou analyzovány pomocí softwaru Agilent Genomic Workbench. Filtrování a klasifikace variant se provede podobným způsobem, jak je popsáno pro SNV a indely.

Všechny relevantní varianty klasifikované jako patogenní a pravděpodobně patogenní budou podrobeny ortogonální validaci (Sangerovo sekvenování pro SNV a indely a kapková digitální polymerázová řetězová reakce pro CNV). Všichni účastníci, kteří se rozhodnou znát své výsledky, obdrží podrobné zprávy včetně všech relevantních variant nejistého významu (VUS), stejně jako pravděpodobných patogenních a patogenních variant s interpretací jejich klinického významu. Pokud je to klinicky indikováno, bude účastníkům nabídnuto kaskádově cílené screeningové vyšetření dalších členů rodiny. Vybrané VUS, včetně variant, které nebyly dříve hlášeny, budou podrobeny dalším hodnocením, včetně hledání ztráty heterozygotnosti v nádorových tkáních, expresním testům, sekvenování kódující DNA a/nebo analýze bodu zlomu v krvi a/nebo nádorových tkáních nebo experimentální funkční validaci.

Genetické výsledky budou korelovány s klinickými údaji, aby se určila frekvence a typ genetických defektů spojených s každým fenotypem ve studované populaci. Naopak budou získány důkladné klinické popisy repertoáru fenotypů spojených s každým konkrétním genetickým defektem. Bude také zkoumán vliv jednotlivých genotyp-fenotypových asociací na klinický obraz a klinické výsledky. Případy bez genetické diagnózy po cíleném NGS a aCGH budou podrobeny exomovému sekvenování. Skupiny pacientů s podobnými fenotypy budou společně analyzovány za účelem identifikace defektů specifických pro onemocnění v genech, které dříve nebyly spojeny s NEN. Nové kandidátské asociace budou důkladně charakterizovány pomocí na míru navržených kombinací experimentálních přístupů plus dodatečného screeningu v postižených rodinách.

Očekávané výsledky.

Začlenění více fenotypů NEN do navrhované nové platformy pro obecné genotypování významně zlepší pravděpodobnost detekce variant ve srovnání s aktuálně dostupnými genetickými testy. Kromě generování velkého množství genetických a klinických dat pro dříve neprozkoumané fenotypy ve studované populaci tento projekt velmi pravděpodobně také identifikuje nové modifikátory onemocnění a základní varianty. Tato data přispějí k rozvoji populačně a genotypově specifických strategií pro genetické poradenství, včasnou diagnostiku, klinické sledování a léčbu, čímž zlepší budoucí výsledky jedinců s NEN. Tato strategie odhalí krajinu zárodečných a somatických defektů spojených s NEN v extrémně geneticky různorodé populaci, která je v mezinárodních studiích málo zastoupena. Výsledky budou porovnány s údaji z jiných populací, aby bylo možné lépe porozumět změnám uvnitř i vně známých hnacích genů, které utvářejí syndromické projevy, chování nádorů a dědičné vzorce v NEN.