Bases genéticas de las neoplasias neuroendocrinas en pacientes mexicanos

Introducción.

Las NEN son un grupo heterogéneo de neoplasias humanas con un comportamiento clínico variable, que abarca desde la indolencia hasta la franca agresividad y la malignidad. Surgen de diversos tejidos con orígenes embriológicos comunes que comparten la capacidad de producir hormonas. Su crecimiento puede comprometer las estructuras circundantes y a menudo causan una morbilidad significativa debido a los síndromes asociados de sobresecreción hormonal. Aunque tradicionalmente se consideran raras, la frecuencia de las NEN ha aumentado considerablemente en las últimas décadas, debido a una mejor conciencia clínica y estrategias de diagnóstico. Este grupo incluye lesiones como NEN broncopulmonares, gastrointestinales, pancreáticas y tímicas, carcinoma medular de tiroides (MTC), paragangliomas y feocromocitomas (PPGL), adenomas y carcinomas de paratiroides y tumores neuroendocrinos hipofisarios (PitNET), entre otras.

Curiosamente, las NEN se encuentran entre las neoplasias humanas con un componente hereditario más fuerte. Algunas NEN son parte de síndromes autosómicos dominantes de neoplasia endocrina múltiple, donde se presentan en combinación con otros tumores endocrinos y no endocrinos característicos en el mismo individuo y/o familia. Las descripciones clínicas de este tipo de entidades existen en la literatura desde mediados del siglo XX, aunque sus causas genéticas no fueron determinadas hasta hace tres o cuatro décadas. En otros casos, un solo tipo de tumor, como MTC, PitNET o PPGL, surge en varios miembros de la misma familia, sin otras características asociadas. En ocasiones, los individuos con una presentación aparentemente esporádica son en realidad casos simples de afecciones familiares. Actualmente se sabe que alrededor del 50% de los casos de MTC, el 40% de los PPGL, el 20% de los NEN gastrointestinales, pancreáticos, broncopulmonares y tímicos, el 15% de los NEN paratiroideos y el 5-10% de los PitNET se deben a defectos de la línea germinal. Aparte de los defectos genéticos hereditarios, las alteraciones a nivel somático determinan cursos clínicos específicos tanto en las NEN esporádicas como en las familiares.

En la última década, el uso generalizado de potentes herramientas para análisis genéticos ha dado lugar a un aumento espectacular de las causas genéticas conocidas de las NEN. Estos enfoques también han producido asociaciones genotipo-fenotipo previamente insospechadas y han descubierto una gran superposición en la presentación clínica de diferentes síndromes de neoplasia endocrina múltiple. Las pruebas genéticas son clave para el diagnóstico temprano, el manejo clínico personalizado y el asesoramiento genético. Además, los análisis genéticos de los tumores han descubierto posibles biomarcadores y dianas terapéuticas. Sin embargo, las plataformas para el diagnóstico genético no están ampliamente disponibles y los datos sobre los factores genéticos que causan enfermedades no representan con precisión a todas las poblaciones humanas. Las pruebas genéticas no están ampliamente disponibles en México y son casi inexistentes en sus hospitales públicos, que atienden a la mayoría de los aproximadamente 128 millones de habitantes del país. Curiosamente, los mestizos, que representan la mayor parte de la población mexicana, son uno de los grupos humanos genéticamente más diversos. Las estrategias de medicina de precisión requieren información específica de la población; sin embargo, los mestizos mexicanos están pobremente representados en las bases de datos genéticas internacionales.

Objetivos.

Utilizando una plataforma de prueba precisa, sólida y asequible, este proyecto describirá el repertorio y la frecuencia de las causas genéticas somáticas y de la línea germinal de las NEN en una gran cohorte prospectiva de mestizos mexicanos. También definirá los fenotipos y los resultados clínicos asociados con defectos genéticos específicos y explorará las consecuencias funcionales de nuevos defectos en genes previamente asociados con estas neoplasias. Finalmente, descubrirá y caracterizará en profundidad nuevas asociaciones genéticas, incluidos posibles objetivos farmacológicos.

Métodos.

La aprobación para el estudio se obtuvo de los Comités de Revisión Institucional de dos hospitales de referencia: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, proyecto 4090), y Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, proyecto R-2022-785-011). Bajo consentimiento informado, se obtendrán muestras de ADN de sangre y tumores frescos o fijados con formalina e incluidos en parafina. Todos los métodos experimentales, excepto la secuenciación del exoma, se llevarán a cabo en la Red de Apoyo a la Investigación de la Universidad Nacional Autónoma de México y el INCMNSZ. El estudio comenzó en agosto de 2022 y está diseñado como una cohorte prospectiva de 15 años con un total estimado de 750 participantes. Se invitará a participar a personas adultas (edad ≥18 años en el momento del reclutamiento) con diagnóstico nuevo o previo de cualquier tipo de NEN, incluidas presentaciones esporádicas, familiares, aisladas y sindrómicas. A todos los participantes se les ofrecerá la oportunidad de obtener los resultados de sus estudios genéticos. Se utilizará un código único no identificado para etiquetar todas las muestras y datos recopilados de cada participante, para proteger su información personal.

Los detalles sobre antecedentes familiares, presentación clínica, estudios bioquímicos, de imágenes, histopatológicos y genéticos previos de cada participante se ingresarán en una base de datos clínica electrónica no identificada. Los datos sobre los resultados clínicos se recopilarán de forma prospectiva durante un máximo de 15 años. Para todos los casos, se recolectará una muestra de sangre periférica de 5 ml en un tubo con EDTA en el momento del reclutamiento y se almacenará a 4 ° C hasta su procesamiento. El ADN se extraerá de las muestras de sangre dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. Se obtendrán muestras de tejido de archivo fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) para pacientes con resección tumoral previa, cuando estén disponibles. Cuando sea posible y sin interferir con los análisis histopatológicos de rutina, se obtendrán muestras de tejido fresco congelado de personas sometidas a escisión quirúrgica de tumores en el curso del estudio. Los tejidos congelados se almacenarán en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. Se extraerá ADN de todas las muestras de tejido y se extraerá ARN de muestras de sangre o tejido en casos seleccionados. La calidad y concentración de la muestra se analizarán mediante espectrofotometría y fluorometría. El ADN se almacenará a -20 °C y el ARN se almacenará a -80 °C durante la duración del estudio.

Las muestras de ADN se analizarán utilizando múltiples técnicas, que consistirán en un primer paso de secuenciación dirigida de próxima generación (NGS), seguida de una hibridación genómica comparativa basada en matrices dirigidas (aCGH) y una secuenciación del exoma (ES). Para NGS, se ha diseñado un panel personalizado que incluye 54 genes con una asociación conocida con NEN, utilizando la plataforma Twist Biosciences. Se prepararán bibliotecas de ADN sanguíneo de todos los participantes y, cuando sea posible, ADN tumoral fresco, según las instrucciones del fabricante y se secuenciarán en un instrumento Illumina MiSeq a una profundidad aproximada de 300x. Las secuencias se asignarán al genoma humano GRCh38/hg38, se marcarán los duplicados de PCR y se realizará la llamada de variantes para variantes de un solo nucleótido (SNV), indeles y variantes de número de copia. Las variantes se seleccionarán en función de su frecuencia (<0.1% en las bases de datos de población general y de población mexicana), clasificación previa (según las pautas del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica y de la Asociación de Patología Molecular) reportada en ClinVar, resultados de múltiples en herramientas de predicción silico y búsqueda bibliográfica de datos clínicos y experimentales adicionales.

Para los casos seleccionados que queden sin diagnóstico genético después del panel NGS, se llevarán a cabo análisis CNV de las mismas regiones objetivo. Para ello, se ha diseñado un aCGH de alta densidad dirigido a las mismas regiones de interés que el panel NGS, utilizando la plataforma Agilent SureDesign. Las muestras se procesarán en un formato de matriz de 16 x 25 K y los resultados se analizarán con el software Agilent Genomic Workbench. El filtrado y la clasificación de variantes se realizarán de manera similar a la descrita para SNV e indeles.

Todas las variantes relevantes clasificadas como patógenas y probablemente patógenas se someterán a una validación ortogonal (secuenciación de Sanger para SNV e indeles y reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas para CNV). Todos los participantes que elijan conocer sus resultados recibirán informes detallados que incluyen todas las variantes relevantes de significado incierto (VUS), así como las variantes patógenas y probables con una interpretación de su importancia clínica. Cuando esté clínicamente indicado, a los participantes se les ofrecerán pruebas de detección específicas en cascada de miembros adicionales de la familia. Las VUS seleccionadas, incluidas las variantes no informadas anteriormente, se someterán a evaluaciones adicionales, incluida la búsqueda de pérdida de heterocigosidad en tejidos tumorales, ensayos de expresión, secuenciación de ADN codificante y/o análisis de puntos de ruptura en sangre y/o tejidos tumorales, o validación funcional experimental.

Los resultados genéticos se correlacionarán con los datos clínicos para determinar la frecuencia y tipo de defectos genéticos asociados a cada fenotipo en la población de estudio. Por el contrario, se obtendrán descripciones clínicas exhaustivas del repertorio de fenotipos asociados a cada defecto genético específico. También se explorará la influencia de asociaciones particulares de genotipo-fenotipo en la presentación clínica y los resultados clínicos. Los casos sin diagnóstico genético después de NGS y aCGH dirigidas se someterán a la secuenciación del exoma. Se analizarán juntos grupos de pacientes con fenotipos similares para identificar defectos específicos de la enfermedad en genes no asociados previamente con NEN. Las nuevas asociaciones candidatas se caracterizarán minuciosamente utilizando combinaciones de enfoques experimentales diseñadas a medida más pruebas adicionales en familias afectadas.

Resultados previstos.

La incorporación de múltiples fenotipos de NEN en la nueva plataforma propuesta para el genotipado general mejorará significativamente la probabilidad de detección de variantes, en comparación con las pruebas genéticas disponibles actualmente. Además de generar una gran cantidad de datos genéticos y clínicos para fenotipos previamente inexplorados en la población de estudio, es muy probable que este proyecto también identifique nuevos modificadores de enfermedades y variantes fundadoras. Estos datos contribuirán al desarrollo de estrategias específicas de población y genotipo para el asesoramiento genético, el diagnóstico temprano, el seguimiento clínico y el tratamiento, mejorando así los resultados futuros de las personas con NEN. Esta estrategia descubrirá el panorama de los defectos somáticos y de la línea germinal asociados a NEN en una población genéticamente diversa que está poco representada en los estudios internacionales. Los resultados se compararán con datos de otras poblaciones para comprender mejor las alteraciones dentro y fuera de los genes impulsores conocidos que dan forma a las presentaciones sindrómicas, los comportamientos tumorales y los patrones de herencia en las NEN.