멕시코 환자의 신경내분비 종양의 유전적 기초

소개.

NEN은 나태함부터 노골적인 공격성 및 악성 종양에 이르기까지 다양한 임상 행동을 보이는 이질적인 인간 신생물 그룹입니다. 이는 호르몬 생산 능력을 공유하는 공통의 발생학적 기원을 가진 다양한 조직에서 발생합니다. 이들의 성장은 주변 구조를 손상시킬 수 있으며 관련 호르몬 과다분비 증후군으로 인해 심각한 질병을 일으키는 경우가 많습니다. 전통적으로 드문 것으로 간주되었지만 NEN의 빈도는 향상된 임상 인식 및 진단 전략으로 인해 지난 수십 년 동안 크게 증가했습니다. 이 그룹에는 기관지폐, 위장관, 췌장 및 흉선 NEN, 갑상선 수질암종(MTC), 부신경절종 및 크롬친화세포종(PPGL), 부갑상선 선종 및 암종, 뇌하수체 신경내분비 종양(PitNET)과 같은 병변이 포함됩니다.

흥미롭게도 NEN은 유전적 구성 요소가 가장 강한 인간 신생물 중 하나입니다. 일부 NEN은 다발성 내분비 종양의 상염색체 우성 증후군의 일부이며, 동일한 개인 및/또는 가족에서 다른 특징적인 내분비 및 비내분비 종양과 함께 나타납니다. 그러한 개체에 대한 임상적 설명은 20세기 중반 이후 문헌에 존재하지만, 그 유전적 원인은 30~40년 전까지는 밝혀지지 않았습니다. 다른 경우에는 MTC, PitNET 또는 PPGL과 같은 단일 유형의 종양이 다른 연관된 특징 없이 동일한 계열의 여러 구성원에서 발생합니다. 가끔 명백히 산발적으로 나타나는 개인이 실제로 가족성 질환의 단순 사례인 경우도 있습니다. 현재 MTC의 약 50%, PPGL의 40%, 위장관, 췌장, 기관지폐 및 흉선 NEN의 20%, 부갑상선 NEN의 15%, PitNET의 5-10%가 생식선 결함으로 인한 것으로 알려져 있습니다. 유전성 유전적 결함 외에도 체세포 수준의 변화는 산발성 및 가족성 NEN 모두에서 특정 임상 과정을 결정합니다.

지난 10년 동안 유전자 분석을 위한 강력한 도구의 광범위한 사용으로 인해 NEN의 알려진 유전적 원인이 극적으로 증가했습니다. 이러한 접근법은 또한 이전에 예상하지 못한 유전자형-표현형 연관성을 가져왔고 다발성 내분비 종양의 다양한 증후군의 임상적 표현에서 큰 중복을 밝혀냈습니다. 유전자 검사는 조기 진단, 맞춤형 임상 관리, 유전 상담의 핵심입니다. 더욱이, 종양에 대한 유전적 분석을 통해 잠재적인 바이오마커와 치료 표적이 밝혀졌습니다. 그러나 유전 진단을 위한 플랫폼은 널리 이용 가능하지 않으며 유전 질환 동인에 대한 데이터가 모든 인구 집단을 정확하게 대표하지 않습니다. 유전자 검사는 멕시코에서 널리 이용 가능하지 않으며, 약 1억 2,800만 인구의 대다수를 대상으로 하는 공립 병원에는 거의 존재하지 않습니다. 흥미롭게도 멕시코 인구의 대부분을 차지하는 메스티조는 유전적으로 가장 다양한 인간 집단 중 하나입니다. 정밀 의학 전략에는 인구별 정보가 필요하지만 멕시코 메스티조는 국제 유전자 데이터베이스에서 제대로 표현되지 않습니다.

목표.

정확하고 강력하며 저렴한 테스트 플랫폼을 사용하여 이 프로젝트는 멕시코 메스티조의 대규모 유망 코호트에서 NEN의 생식계열 및 체세포 유전적 원인의 레퍼토리와 빈도를 설명합니다. 또한 특정 유전적 결함과 관련된 표현형 및 임상 결과를 정의하고 이전에 이러한 신생물과 관련된 유전자의 새로운 결함으로 인한 기능적 결과를 탐구합니다. 마지막으로, 잠재적인 약물 표적을 포함하여 새로운 유전적 연관성을 찾아내고 철저하게 특성화할 것입니다.

행동 양식.

연구에 대한 승인은 두 개의 참고 병원인 Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán(INCMNSZ, 프로젝트 4090)과 Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social( IMSS, 프로젝트 R-2022-785-011). 사전 동의 하에 혈액과 신선 종양 또는 포르말린 고정 및 파라핀 포매 종양에서 DNA 샘플을 채취합니다. 엑솜 시퀀싱을 제외한 모든 실험 방법은 Universidad Nacional Autónoma de México 및 INCMNSZ의 연구 지원 네트워크에서 수행됩니다. 이 연구는 2022년 8월에 시작되었으며 총 750명의 참가자가 참여하는 15년간의 전향적 코호트로 설계되었습니다. 산발성, 가족성, 고립성 및 증후군 증상을 포함하여 모든 유형의 NEN에 대한 새로운 진단 또는 이전 진단을 받은 성인 개인(모집 시 18세 이상)이 참여하도록 초대됩니다. 모든 참가자에게는 유전자 연구 결과를 얻을 수 있는 기회가 제공됩니다. 개인 정보를 보호하기 위해 고유한 식별되지 않은 코드를 사용하여 각 참가자에 대해 수집된 모든 샘플과 데이터에 라벨을 붙입니다.

각 참가자의 가족력, 임상 증상, 생화학, 영상, 조직병리학 및 이전 유전 연구에 대한 세부 정보는 식별되지 않은 전자 임상 데이터베이스에 입력됩니다. 임상 결과에 대한 데이터는 최대 15년간 전향적으로 수집됩니다. 모든 경우에 대해 모집 시 EDTA가 포함된 튜브에 5ml의 말초 혈액 샘플을 수집하고 처리할 때까지 4°C에서 보관합니다. DNA는 수집 후 24시간 이내에 혈액 샘플에서 추출됩니다. 가능한 경우 이전에 종양 절제술을 받은 환자에 대해 보관된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 샘플을 채취합니다. 가능하다면 일상적인 조직병리학적 분석을 방해하지 않고 연구 과정에서 외과적 종양 절제를 받은 개인으로부터 신선한 냉동 조직 샘플을 얻을 것입니다. 냉동 조직은 처리될 때까지 액체 질소에 보관됩니다. DNA는 모든 조직 샘플에서 추출되며, 일부 경우에는 혈액이나 조직 샘플에서 RNA가 추출됩니다. 샘플 품질과 농도는 분광광도법과 형광측정법으로 분석됩니다. 연구 기간 동안 DNA는 -20°C에 저장되고 RNA는 -80°C에 저장됩니다.

DNA 샘플은 표적화된 차세대 서열분석(NGS)의 첫 번째 단계, 이어서 표적화된 어레이 기반 비교 게놈 혼성화(aCGH) 및 엑솜 서열분석(ES)으로 구성된 다양한 기술을 사용하여 분석됩니다. NGS의 경우 Twist Biosciences 플랫폼을 사용하여 NEN과 연관된 것으로 알려진 54개의 유전자를 포함하는 맞춤형 패널이 설계되었습니다. 모든 참가자의 혈액 DNA 라이브러리와 가능한 경우 신선한 종양 DNA는 제조업체의 지침에 따라 준비되고 Illumina MiSeq 기기에서 대략 300x 깊이로 시퀀싱됩니다. 서열은 GRCh38/hg38 인간 게놈에 매핑되고, PCR 중복이 표시되며, 단일 뉴클레오티드 변형(SNV), 삽입 삭제 및 카피 번호 변형에 대해 변형 호출이 수행됩니다. 변종은 빈도(일반 인구 및 멕시코 인구 데이터베이스 모두에서 <0.1%), ClinVar에 보고된 이전 분류(미국 의학 유전학 및 유전체학 협회 및 분자 병리학 협회 지침에 따름), silico 예측 도구 및 추가 임상 및 실험 데이터에 대한 문헌 검색.

NGS 패널 이후 유전자 진단이 이루어지지 않은 일부 사례에 대해서는 동일한 표적 부위에 대한 CNV 분석이 수행됩니다. 이를 위해 Agilent SureDesign 플랫폼을 사용하여 NGS 패널과 동일한 관심 영역을 대상으로 하는 고밀도 aCGH를 설계했습니다. 샘플은 16 x 25 K 어레이 형식으로 처리되며 결과는 Agilent Genomic Workbench 소프트웨어로 분석됩니다. 변형 필터링 및 분류는 SNV 및 indel에 대해 설명한 것과 유사한 방식으로 수행됩니다.

병원성 및 병원성 가능성이 있는 것으로 분류된 모든 관련 변종은 직교 검증을 받게 됩니다(SNV 및 indel에 대한 Sanger 서열 분석 및 CNV에 대한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응). 결과를 알기로 선택한 모든 참가자는 임상적 중요성에 대한 해석과 함께 모든 관련 불확실한 변종(VUS)은 물론 병원성일 가능성이 있는 변종과 병원성 변종을 포함한 자세한 보고서를 받게 됩니다. 임상적으로 필요한 경우 참가자에게는 추가 가족 구성원에 대한 다단계 표적 검사가 제공됩니다. 이전에 보고되지 않은 변종을 포함하여 선택된 VUS는 종양 조직의 이형접합성 손실 검색, 발현 분석, 코딩 DNA 서열 분석 및/또는 혈액 및/또는 종양 조직의 중단점 분석 또는 실험적 기능 검증을 포함한 추가 평가를 받게 됩니다.

유전적 결과는 임상 데이터와 상호 연관되어 연구 집단의 각 표현형과 관련된 유전적 결함의 빈도와 유형을 결정합니다. 반대로, 각 특정 유전적 결함과 관련된 표현형 레퍼토리에 대한 철저한 임상적 설명을 얻을 수 있습니다. 특정 유전자형-표현형 연관성이 임상적 표현 및 임상 결과에 미치는 영향도 조사됩니다. 표적화된 NGS 및 aCGH 이후 유전적 진단이 없는 사례는 엑솜 서열분석을 받게 됩니다. 유사한 표현형을 가진 환자 그룹을 함께 분석하여 이전에 NEN과 관련되지 않은 유전자의 질병 특정 결함을 식별합니다. 새로운 후보 협회는 영향을 받은 가족에 대한 추가 검사와 실험적 접근 방식의 맞춤 설계 조합을 사용하여 철저하게 특성화됩니다.

예상되는 결과.

일반 유전형 분석을 위해 제안된 새로운 플랫폼에 NEN의 여러 표현형을 통합하면 현재 사용 가능한 유전자 검사에 비해 변이체 검출 확률이 크게 향상됩니다. 연구 집단에서 이전에 탐구되지 않은 표현형에 대한 대량의 유전적 및 임상적 데이터를 생성하는 것 외에도, 이 프로젝트는 새로운 질병 변형자와 창시자 변종을 식별할 가능성이 매우 높습니다. 이러한 데이터는 유전 상담, 조기 진단, 임상 추적 및 치료를 위한 인구 및 유전자형별 전략 개발에 기여하여 NEN 환자의 향후 결과를 향상시킵니다. 이 전략은 국제 연구에서 제대로 표현되지 않은 유전적으로 매우 다양한 인구 집단에서 생식계열 및 체세포 NEN 관련 결함의 환경을 밝힐 것입니다. NEN의 증후군 발현, 종양 행동 및 유전 패턴을 형성하는 알려진 드라이버 유전자 내부 및 외부의 변경을 더 잘 이해하기 위해 결과를 다른 인구 집단의 데이터와 비교합니다.