Генетические основы нейроэндокринных новообразований у мексиканских пациентов

Введение.

НЭН представляют собой гетерогенную группу новообразований человека с вариабельным клиническим поведением, варьирующимся от ленивости до явной агрессивности и злокачественности. Они возникают из различных тканей общего эмбриологического происхождения, имеющих общую способность вырабатывать гормоны. Их рост может поставить под угрозу окружающие структуры, и они часто вызывают серьезные заболевания из-за связанных с ними синдромов избыточной секреции гормонов. Хотя традиционно НЭН традиционно считаются редкими, частота НЭН значительно возросла за последние десятилетия благодаря улучшению клинической осведомленности и диагностических стратегий. В эту группу входят, среди прочего, такие поражения, как бронхолегочные, желудочно-кишечные, поджелудочные и тимусные НЭН, медуллярный рак щитовидной железы (МТС), параганглиомы и феохромоцитомы (ППГЛ), аденомы и карциномы паращитовидной железы, нейроэндокринные опухоли гипофиза (ПитНЭО) и другие.

Интересно, что НЭН относятся к числу новообразований человека с наиболее сильным наследственным компонентом. Некоторые НЭН являются частью аутосомно-доминантных синдромов множественной эндокринной неоплазии, где они присутствуют в сочетании с другими характерными эндокринными и неэндокринными опухолями у одного и того же человека и/или семьи. Клинические описания таких заболеваний существуют в литературе с середины двадцатого века, хотя их генетические причины были определены только три или четыре десятилетия назад. В других случаях один тип опухоли, такой как MTC, PitNET или PPGL, возникает у нескольких членов одной семьи без других связанных особенностей. Иногда люди с очевидно спорадическими проявлениями действительно являются простыми случаями семейных заболеваний. В настоящее время известно, что около 50% случаев МТС, 40% ППГЛ, 20% НЭН желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы, бронхолегочной системы и тимуса, 15% НЭН паращитовидной железы и 5-10% ПитНЭО обусловлены дефектами зародышевой линии. Помимо наследственных генетических дефектов, изменения на соматическом уровне определяют специфическое клиническое течение как спорадических, так и семейных НЭН.

За последнее десятилетие широкое использование мощных инструментов генетического анализа привело к резкому увеличению числа известных генетических причин НЭН. Эти подходы также выявили ранее не подозревавшиеся ассоциации генотип-фенотип и выявили большое совпадение в клинических проявлениях различных синдромов множественной эндокринной неоплазии. Генетические тесты имеют ключевое значение для ранней диагностики, индивидуального клинического ведения и генетического консультирования. Более того, генетический анализ опухолей выявил потенциальные биомаркеры и терапевтические мишени. Тем не менее, платформы для генетической диагностики не являются широко доступными, а данные о факторах генетических заболеваний не отражают точно все человеческие популяции. Генетические тесты не широко доступны в Мексике и почти отсутствуют в государственных больницах, которые обслуживают большую часть населения страны, составляющего около 128 миллионов человек. Интересно, что метисы, составляющие большую часть населения Мексики, являются одной из самых генетически разнообразных групп людей. Стратегии точной медицины требуют информации по конкретной популяции, однако мексиканские метисы плохо представлены в международных генетических базах данных.

Цели.

Используя точную, надежную и доступную платформу тестирования, этот проект опишет репертуар и частоту зародышевых и соматических генетических причин НЭН в большой перспективной когорте мексиканских метисов. Он также определит фенотипы и клинические результаты, связанные с конкретными генетическими дефектами, и исследует функциональные последствия новых дефектов в генах, ранее связанных с этими новообразованиями. Наконец, это позволит выявить и тщательно охарактеризовать новые генетические ассоциации, включая потенциальные мишени, поддающиеся воздействию лекарств.

Методы.

Одобрение исследования было получено от институциональных наблюдательных советов двух справочных больниц: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, проект 4090) и Hospital de Especialidades de Centro Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social (Instituto Mexicano del Seguro Social). ИМСС, проект Р-2022-785-011). При наличии информированного согласия будут получены образцы ДНК из крови и свежих или фиксированных формалином и залитых в парафин опухолей. Все экспериментальные методы, за исключением секвенирования экзома, будут осуществляться в Сети поддержки исследований Национального автономного университета Мексики и INCMNSZ. Исследование началось в августе 2022 года и рассчитано на 15-летнюю проспективную группу с предполагаемым общим количеством участников 750 человек. К участию будут приглашены взрослые лица (возраст ≥18 лет на момент набора) с новым или предыдущим диагнозом любого типа НЭН, включая спорадические, семейные, изолированные и синдромальные проявления. Всем участникам будет предложена возможность получить результаты своих генетических исследований. Уникальный обезличенный код будет использоваться для маркировки всех образцов и данных, собранных для каждого участника, для защиты его личной информации.

Подробная информация о семейном анамнезе, клинической картине, биохимических, визуализирующих, гистопатологических и предыдущих генетических исследованиях для каждого участника будет введена в обезличенную электронную клиническую базу данных. Данные о клинических результатах будут собираться проспективно в течение максимум 15 лет. Во всех случаях образец периферической крови объемом 5 мл будет собираться в пробирку с ЭДТА при наборе и храниться при температуре 4°C до обработки. ДНК будет извлечена из образцов крови в течение 24 часов после сбора. Архивные образцы тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE), будут получены у пациентов с предыдущей резекцией опухоли, если таковые имеются. По возможности и без вмешательства в рутинные гистопатологические анализы образцы свежезамороженной ткани будут получены от лиц, перенесших хирургическое удаление опухоли в ходе исследования. Замороженные ткани будут храниться в жидком азоте до обработки. ДНК будет выделена из всех образцов тканей, а в отдельных случаях РНК будет выделена из образцов крови или тканей. Качество и концентрация проб будут анализироваться методами спектрофотометрии и флуорометрии. ДНК будет храниться при -20 °C, а РНК — при -80 °C на протяжении всего исследования.

Образцы ДНК будут анализироваться с использованием нескольких методов, включая первый этап целевого секвенирования следующего поколения (NGS), за которым последует целевая сравнительная геномная гибридизация на основе массивов (aCGH) и секвенирование экзома (ES). Для NGS с использованием платформы Twist Biosciences была разработана индивидуальная панель, включающая 54 гена, которые, как известно, связаны с NEN. Библиотеки ДНК крови всех участников и, если возможно, ДНК свежих опухолей будут подготовлены в соответствии с инструкциями производителя и секвенированы в приборе Illumina MiSeq на приблизительной глубине 300x. Последовательности будут сопоставлены с геномом человека GRCh38/hg38, дубликаты ПЦР будут отмечены, а вызов вариантов будет выполнен для однонуклеотидных вариантов (SNV), инделей и вариантов числа копий. Варианты будут выбраны на основе их частоты (<0,1% как в базах данных населения в целом, так и в популяциях Мексики), предыдущей классификации (в соответствии с рекомендациями Американского колледжа медицинской генетики и геномики и Ассоциации молекулярной патологии), представленной в ClinVar, результатов множественных исследований. инструменты прогнозирования silico и поиск литературы для получения дополнительных клинических и экспериментальных данных.

Для отдельных случаев, оставшихся без генетического диагноза после панели NGS, будет проведен CNV-анализ тех же целевых регионов. Для этой цели с использованием платформы Agilent SureDesign был разработан aCGH высокой плотности, нацеленный на те же области интереса, что и панель NGS. Образцы будут обработаны в формате массива 16 x 25 K, а результаты будут проанализированы с помощью программного обеспечения Agilent Genomic Workbench. Фильтрация и классификация вариантов будут выполняться таким же образом, как описано для SNV и indels.

Все соответствующие варианты, классифицированные как патогенные и вероятно патогенные, будут подвергнуты ортогональной проверке (секвенирование по Сэнгеру для SNV и инделей и капельная цифровая полимеразная цепная реакция для CNV). Все участники, решившие узнать свои результаты, получат подробные отчеты, включающие все соответствующие варианты неопределенного значения (VUS), а также вероятные патогенные и патогенные варианты с интерпретацией их клинического значения. При наличии клинических показаний участникам будет предложен каскадный целевой скрининг дополнительных членов семьи. Выбранные VUS, включая варианты, о которых ранее не сообщалось, будут подвергнуты дополнительным оценкам, включая поиск потери гетерозиготности в опухолевых тканях, анализы экспрессии, секвенирование кодирующей ДНК и/или анализ точек разрыва в крови и/или опухолевых тканях или экспериментальную функциональную проверку.

Генетические результаты будут сопоставлены с клиническими данными для определения частоты и типа генетических дефектов, связанных с каждым фенотипом в исследуемой популяции. И наоборот, будут получены подробные клинические описания репертуара фенотипов, связанных с каждым конкретным генетическим дефектом. Также будет изучено влияние определенных ассоциаций генотип-фенотип на клиническую картину и клинические результаты. Случаи без генетического диагноза после целевого NGS и aCGH будут подвергнуты секвенированию экзома. Группы пациентов со схожими фенотипами будут проанализированы вместе, чтобы выявить специфичные для заболевания дефекты в генах, ранее не связанные с НЭН. Новые ассоциации-кандидаты будут тщательно охарактеризованы с использованием специально разработанных комбинаций экспериментальных подходов и дополнительного скрининга в затронутых семьях.

Ожидаемые результаты.

Включение нескольких фенотипов NEN в предлагаемую новую платформу для общего генотипирования значительно повысит вероятность обнаружения вариантов по сравнению с доступными в настоящее время генетическими тестами. Помимо создания большого количества генетических и клинических данных для ранее неизученных фенотипов в исследуемой популяции, этот проект, скорее всего, также позволит выявить новые модификаторы заболевания и варианты-основатели. Эти данные будут способствовать разработке популяционно-генотипических стратегий генетического консультирования, ранней диагностики, клинического наблюдения и лечения, тем самым улучшая будущие результаты лечения людей с НЭН. Эта стратегия позволит раскрыть ландшафт зародышевых и соматических дефектов, связанных с НЭН, в чрезвычайно генетически разнообразной популяции, которая плохо представлена ​​в международных исследованиях. Результаты будут сравниваться с данными других популяций, чтобы лучше понять изменения внутри и за пределами известных генов-драйверов, которые формируют синдромные проявления, поведение опухолей и модели наследования при НЭН.