Genetische Grundlagen neuroendokriner Neoplasien bei mexikanischen Patienten

Einführung.

NENs sind eine heterogene Gruppe menschlicher Neoplasien mit einem variablen klinischen Verhalten, das von Trägheit bis hin zu offener Aggressivität und Bösartigkeit reicht. Sie entstehen aus verschiedenen Geweben mit gemeinsamem embryologischem Ursprung, die sich die Fähigkeit zur Hormonproduktion teilen. Ihr Wachstum kann die umgebenden Strukturen gefährden und aufgrund der damit verbundenen Syndrome einer übermäßigen Hormonsekretion verursachen sie oft eine erhebliche Morbidität. Obwohl traditionell als selten angesehen, hat die Häufigkeit von NEN in den letzten Jahrzehnten aufgrund des verbesserten klinischen Bewusstseins und der verbesserten Diagnosestrategien stark zugenommen. Zu dieser Gruppe gehören unter anderem Läsionen wie bronchopulmonale, gastrointestinale, Pankreas- und Thymus-NEN, medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC), Paragangliome und Phäochromozytome (PPGLs), Nebenschilddrüsenadenome und -karzinome sowie neuroendokrine Tumoren der Hypophyse (PitNETs).

Interessanterweise gehören NEN zu den menschlichen Neoplasien mit einer stärksten vererbbaren Komponente. Einige NEN sind Teil autosomal-dominant vererbter Syndrome multipler endokriner Neoplasien, bei denen sie in Kombination mit anderen charakteristischen endokrinen und nicht-endokrinen Tumoren im selben Individuum und/oder in der gleichen Familie auftreten. Klinische Beschreibungen solcher Erkrankungen gibt es in der Literatur seit der Mitte des 20. Jahrhunderts, obwohl ihre genetischen Ursachen erst vor drei oder vier Jahrzehnten ermittelt wurden. In anderen Fällen tritt ein einzelner Tumortyp wie MTC, PitNETs oder PPGLs bei mehreren Mitgliedern derselben Familie auf, ohne dass andere damit verbundene Merkmale vorliegen. Gelegentlich handelt es sich bei Personen mit scheinbar sporadischem Auftreten tatsächlich um einfache Fälle familiärer Erkrankungen. Derzeit ist bekannt, dass etwa 50 % der MTC-Fälle, 40 % der PPGLs, 20 % der gastrointestinalen, pankreatischen, bronchopulmonalen und thymischen NENs, 15 % der Nebenschilddrüsen-NENs und 5–10 % der PitNETs auf Keimbahndefekte zurückzuführen sind. Abgesehen von vererbbaren genetischen Defekten bestimmen Veränderungen auf somatischer Ebene spezifische klinische Verläufe sowohl bei sporadischen als auch bei familiären NENs.

Im letzten Jahrzehnt hat der weit verbreitete Einsatz leistungsstarker Werkzeuge für genetische Analysen zu einem dramatischen Anstieg der bekannten genetischen Ursachen von NENs geführt. Diese Ansätze haben auch bisher unvermutete Genotyp-Phänotyp-Zusammenhänge hervorgebracht und große Überschneidungen im klinischen Erscheinungsbild verschiedener Syndrome der multiplen endokrinen Neoplasie aufgedeckt. Gentests sind von entscheidender Bedeutung für eine frühzeitige Diagnose, ein maßgeschneidertes klinisches Management und eine genetische Beratung. Darüber hinaus haben genetische Analysen der Tumoren potenzielle Biomarker und therapeutische Angriffspunkte aufgedeckt. Dennoch sind Plattformen für die genetische Diagnose nicht allgemein verfügbar und Daten zu genetischen Krankheitstreibern spiegeln nicht alle menschlichen Populationen genau wider. Gentests sind in Mexiko nicht allgemein verfügbar und in den öffentlichen Krankenhäusern, in denen die Mehrheit der etwa 128 Millionen Einwohner des Landes versorgt wird, gibt es sie fast nicht. Interessanterweise sind Mestizen, die den größten Teil der mexikanischen Bevölkerung ausmachen, eine der genetisch vielfältigsten menschlichen Gruppen. Präzisionsmedizinische Strategien erfordern bevölkerungsspezifische Informationen, dennoch sind mexikanische Mestizen in internationalen genetischen Datenbanken kaum vertreten.

Ziele.

Mithilfe einer präzisen, robusten und erschwinglichen Testplattform wird dieses Projekt das Repertoire und die Häufigkeit von Keimbahn- und somatischen genetischen Ursachen von NENs in einer großen potenziellen Kohorte mexikanischer Mestizen beschreiben. Darüber hinaus werden die Phänotypen und klinischen Ergebnisse im Zusammenhang mit bestimmten genetischen Defekten definiert und die funktionellen Konsequenzen neuer Defekte in Genen untersucht, die zuvor mit diesen Neoplasien in Verbindung gebracht wurden. Schließlich werden neuartige genetische Zusammenhänge, einschließlich potenzieller medikamentöser Ziele, aufgedeckt und gründlich charakterisiert.

Methoden.

Die Genehmigung für die Studie wurde von den Institutional Review Boards zweier Referenzkrankenhäuser eingeholt: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, Projekt 4090) und Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, Projekt R-2022-785-011). Mit Einverständniserklärung werden DNA-Proben aus Blut und frischen oder formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Tumoren entnommen. Alle experimentellen Methoden, mit Ausnahme der Exomsequenzierung, werden im Research Support Network der Universidad Nacional Autónoma de México und INCMNSZ durchgeführt. Die Studie begann im August 2022 und ist als 15-jährige prospektive Kohorte mit geschätzten insgesamt 750 Teilnehmern konzipiert. Erwachsene Personen (Alter ≥ 18 Jahre bei der Einstellung) mit neuer oder früherer Diagnose jeglicher Art von NEN werden zur Teilnahme eingeladen, einschließlich sporadischer, familiärer, isolierter und syndromaler Vorfälle. Allen Teilnehmern wird die Möglichkeit geboten, die Ergebnisse ihrer genetischen Studien einzuholen. Zur Kennzeichnung aller für jeden Teilnehmer gesammelten Proben und Daten wird ein eindeutiger, anonymisierter Code verwendet, um deren persönliche Daten zu schützen.

Details zur Familiengeschichte, zum klinischen Erscheinungsbild, zu biochemischen, bildgebenden, histopathologischen und früheren genetischen Studien für jeden Teilnehmer werden in eine nicht identifizierte elektronische klinische Datenbank eingegeben. Daten zu klinischen Ergebnissen werden prospektiv für einen Zeitraum von maximal 15 Jahren erhoben. In allen Fällen wird bei der Rekrutierung eine periphere Blutprobe von 5 ml in einem Röhrchen mit EDTA entnommen und bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert. DNA wird aus Blutproben innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme extrahiert. Archivierte, formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebeproben werden für Patienten mit vorheriger Tumorresektion entnommen, sofern verfügbar. Wenn möglich und ohne Beeinträchtigung routinemäßiger histopathologischer Analysen, werden frisch gefrorene Gewebeproben von Personen entnommen, die sich im Verlauf der Studie einer chirurgischen Tumorentfernung unterziehen. Gefrorenes Gewebe wird bis zur Verarbeitung in flüssigem Stickstoff gelagert. DNA wird aus allen Gewebeproben extrahiert und RNA wird in ausgewählten Fällen aus Blut- oder Gewebeproben extrahiert. Probenqualität und -konzentration werden durch Spektrophotometrie und Fluorometrie analysiert. Die DNA wird für die Dauer der Studie bei -20 °C und die RNA bei -80 °C gelagert.

DNA-Proben werden mit mehreren Techniken analysiert, die aus einem ersten Schritt der gezielten Next-Generation-Sequenzierung (NGS) bestehen, gefolgt von einer gezielten Array-basierten vergleichenden genomischen Hybridisierung (aCGH) und Exomsequenzierung (ES). Für NGS wurde mithilfe der Twist Biosciences-Plattform ein maßgeschneidertes Panel mit 54 Genen mit bekannter Assoziation mit NENs entwickelt. Bibliotheken aus Blut-DNA aller Teilnehmer und, wenn möglich, frischer Tumor-DNA werden gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und in einem Illumina MiSeq-Instrument bei einer ungefähren Tiefe von 300x sequenziert. Sequenzen werden auf das menschliche Genom GRCh38/hg38 abgebildet, PCR-Duplikate werden markiert und Variantenaufrufe werden für Einzelnukleotidvarianten (SNVs), Indels und Kopienzahlvarianten durchgeführt. Die Auswahl der Varianten erfolgt auf der Grundlage ihrer Häufigkeit (<0,1 % sowohl in Datenbanken der Allgemeinbevölkerung als auch in mexikanischen Bevölkerungsdatenbanken), ihrer vorherigen Klassifizierung (gemäß den Richtlinien des American College of Medical Genetics and Genomics und der Association for Molecular Pathology), die in ClinVar gemeldet wurde, und der Ergebnisse mehrerer in silico-Vorhersagetools und Literatursuche nach zusätzlichen klinischen und experimentellen Daten.

Für ausgewählte Fälle, bei denen nach dem NGS-Panel keine genetische Diagnose vorliegt, wird eine CNV-Analyse derselben Zielregionen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde mithilfe der Agilent SureDesign-Plattform ein hochdichtes aCGH entwickelt, das auf dieselben interessierenden Regionen wie das NGS-Panel abzielt. Die Proben werden in einem 16 x 25 K-Array-Format verarbeitet und die Ergebnisse werden mit der Agilent Genomic Workbench-Software analysiert. Die Variantenfilterung und -klassifizierung erfolgt auf ähnliche Weise wie für SNVs und Indels beschrieben.

Alle als pathogen und wahrscheinlich pathogen eingestuften relevanten Varianten werden einer orthogonalen Validierung unterzogen (Sanger-Sequenzierung für SNVs und Indels und digitale Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion für CNVs). Alle Teilnehmer, die ihre Ergebnisse erfahren möchten, erhalten detaillierte Berichte mit allen relevanten Varianten unsicherer Signifikanz (VUS) sowie wahrscheinlichen pathogenen Varianten und pathogenen Varianten mit einer Interpretation ihrer klinischen Bedeutung. Bei klinischer Indikation wird den Teilnehmern ein gezieltes Kaskaden-Screening weiterer Familienmitglieder angeboten. Ausgewählte VUS, einschließlich bisher nicht gemeldeter Varianten, werden zusätzlichen Auswertungen unterzogen, einschließlich der Suche nach Heterozygotieverlust in Tumorgeweben, Expressionstests, kodierender DNA-Sequenzierung und/oder Bruchpunktanalysen in Blut und/oder Tumorgeweben oder experimenteller Funktionsvalidierung.

Die genetischen Ergebnisse werden mit den klinischen Daten korreliert, um die Häufigkeit und Art der genetischen Defekte zu bestimmen, die mit jedem Phänotyp in der Studienpopulation verbunden sind. Umgekehrt werden gründliche klinische Beschreibungen des Repertoires an Phänotypen erhalten, die mit jedem spezifischen genetischen Defekt verbunden sind. Der Einfluss bestimmter Genotyp-Phänotyp-Assoziationen auf das klinische Erscheinungsbild und die klinischen Ergebnisse wird ebenfalls untersucht. Fälle ohne genetische Diagnose nach gezielter NGS und aCGH werden einer Exomsequenzierung unterzogen. Gruppen von Patienten mit ähnlichen Phänotypen werden gemeinsam analysiert, um krankheitsspezifische Defekte in Genen zu identifizieren, die zuvor nicht mit NENs assoziiert waren. Neuartige Kandidatenassoziationen werden mithilfe maßgeschneiderter Kombinationen experimenteller Ansätze und zusätzlicher Screenings in betroffenen Familien gründlich charakterisiert.

Erwartete Ergebnisse.

Die Einbeziehung mehrerer NEN-Phänotypen in die vorgeschlagene neuartige Plattform für die allgemeine Genotypisierung wird die Wahrscheinlichkeit der Variantenerkennung im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Gentests erheblich verbessern. Neben der Generierung einer großen Menge genetischer und klinischer Daten für bisher unerforschte Phänotypen in der Studienpopulation wird dieses Projekt höchstwahrscheinlich auch neue Krankheitsmodifikatoren und Gründervarianten identifizieren. Diese Daten werden zur Entwicklung bevölkerungs- und genotypspezifischer Strategien für genetische Beratung, Frühdiagnose, klinische Nachsorge und Behandlung beitragen und so die zukünftigen Ergebnisse von Personen mit NENs verbessern. Diese Strategie wird die Landschaft der Keimbahn- und somatischen NEN-assoziierten Defekte in einer genetisch äußerst vielfältigen Population aufdecken, die in internationalen Studien kaum vertreten ist. Die Ergebnisse werden mit Daten aus anderen Populationen verglichen, um die Veränderungen innerhalb und außerhalb bekannter Treibergene besser zu verstehen, die syndromale Präsentationen, Tumorverhalten und Vererbungsmuster in NENs beeinflussen.