Bases génétiques des néoplasmes neuroendocrines chez les patients mexicains

Introduction.

Les NEN sont un groupe hétérogène de néoplasmes humains avec un comportement clinique variable, allant de l'indolence à l'agressivité franche et à la malignité. Ils proviennent de divers tissus ayant des origines embryonnaires communes et partageant la capacité de produire des hormones. Leur croissance peut compromettre les structures environnantes et elles entraînent souvent une morbidité importante en raison des syndromes associés de sécrétion hormonale excessive. Bien que traditionnellement considérée comme rare, la fréquence des NEN a considérablement augmenté au cours des dernières décennies, en raison de l'amélioration de la sensibilisation clinique et des stratégies de diagnostic. Ce groupe comprend des lésions telles que les NEN bronchopulmonaires, gastro-intestinaux, pancréatiques et thymiques, le carcinome médullaire de la thyroïde (MTC), les paragangliomes et les phéochromocytomes (PPGL), les adénomes et carcinomes parathyroïdiens et les tumeurs neuroendocrines hypophysaires (PitNET), entre autres.

Il est intéressant de noter que les NEN font partie des néoplasmes humains présentant la composante héréditaire la plus forte. Certains NEN font partie des syndromes autosomiques dominants de néoplasie endocrinienne multiple, où ils se présentent en combinaison avec d'autres tumeurs endocriniennes et non endocriniennes caractéristiques chez le même individu et/ou la même famille. Des descriptions cliniques de telles entités existent dans la littérature depuis le milieu du XXe siècle, bien que leurs causes génétiques n'aient été déterminées qu'il y a trois ou quatre décennies. Dans d'autres cas, un seul type de tumeur, tel que MTC, PitNET ou PPGL, apparaît chez plusieurs membres de la même famille, sans autres caractéristiques associées. Parfois, des individus présentant une présentation apparemment sporadique sont en effet des cas simples de pathologies familiales. On sait actuellement qu'environ 50 % des cas de MTC, 40 % des PPGL, 20 % des NEN gastro-intestinaux, pancréatiques, bronchopulmonaires et thymiques, 15 % des NEN parathyroïdiens et 5 à 10 % des PitNET sont dus à des anomalies germinales. Outre les défauts génétiques héréditaires, les altérations au niveau somatique déterminent l'évolution clinique spécifique des NEN sporadiques et familiaux.

Au cours de la dernière décennie, l’utilisation généralisée d’outils puissants d’analyse génétique a entraîné une augmentation spectaculaire des causes génétiques connues des NEN. Ces approches ont également donné lieu à des associations génotype-phénotype insoupçonnées et ont mis en évidence un grand chevauchement dans la présentation clinique de différents syndromes de néoplasie endocrinienne multiple. Les tests génétiques sont essentiels pour un diagnostic précoce, une prise en charge clinique adaptée et un conseil génétique. De plus, les analyses génétiques des tumeurs ont révélé des biomarqueurs potentiels et des cibles thérapeutiques. Pourtant, les plateformes de diagnostic génétique ne sont pas largement disponibles et les données sur les facteurs déterminants des maladies génétiques ne représentent pas avec précision toutes les populations humaines. Les tests génétiques ne sont pas largement disponibles au Mexique et sont presque inexistants dans les hôpitaux publics, qui desservent la majorité des 128 millions d'habitants du pays. Il est intéressant de noter que les Métis, qui représentent la majeure partie de la population mexicaine, constituent l’un des groupes humains les plus diversifiés génétiquement. Les stratégies de médecine de précision nécessitent des informations spécifiques à la population, mais les métis mexicains sont mal représentés dans les bases de données génétiques internationales.

Objectifs.

À l'aide d'une plate-forme de test précise, robuste et abordable, ce projet décrira le répertoire et la fréquence des causes génétiques germinales et somatiques des NEN dans une vaste cohorte prospective de métis mexicains. Il définira également les phénotypes et les résultats cliniques associés à des défauts génétiques spécifiques et explorera les conséquences fonctionnelles de nouveaux défauts dans les gènes précédemment associés à ces néoplasmes. Enfin, il découvrira et caractérisera en profondeur de nouvelles associations génétiques, y compris des cibles potentielles médicamenteuses.

Méthodes.

L'approbation de l'étude a été obtenue auprès des comités d'examen institutionnel de deux hôpitaux de référence : l'Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projet 4090) et l'Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, projet R-2022-785-011). Sous consentement éclairé, des échantillons d'ADN de sang et de tumeurs fraîches ou fixées au formol et incluses en paraffine seront obtenus. Toutes les méthodes expérimentales, à l'exception du séquençage de l'exome, seront réalisées au Réseau de soutien à la recherche de l'Universidad Nacional Autónoma de México et de l'INCMNSZ. L’étude a débuté en août 2022 et est conçue comme une cohorte prospective de 15 ans avec un total estimé de 750 participants. Les individus adultes (âgés de ≥ 18 ans au recrutement) avec un diagnostic nouveau ou antérieur de tout type de NEN seront invités à participer, y compris des présentations sporadiques, familiales, isolées et syndromiques. Tous les participants se verront offrir la possibilité d'obtenir les résultats de leurs études génétiques. Un code anonymisé unique sera utilisé pour étiqueter tous les échantillons et données collectées pour chaque participant, afin de protéger ses informations personnelles.

Les détails sur les antécédents familiaux, la présentation clinique, les études biochimiques, d'imagerie, histopathologiques et génétiques antérieures pour chaque participant seront saisis dans une base de données clinique électronique anonymisée. Les données sur les résultats cliniques seront collectées de manière prospective pendant un maximum de 15 ans. Pour tous les cas, un échantillon de sang périphérique de 5 ml sera prélevé dans un tube avec EDTA lors du recrutement et conservé à 4°C jusqu'au traitement. L'ADN sera extrait des échantillons de sang dans les 24 heures suivant le prélèvement. Des échantillons de tissus d'archives fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) seront obtenus pour les patients ayant déjà subi une résection tumorale, lorsqu'ils sont disponibles. Lorsque cela est possible et sans interférer avec les analyses histopathologiques de routine, des échantillons de tissus frais congelés seront obtenus auprès d'individus subissant une excision chirurgicale de tumeur au cours de l'étude. Les tissus congelés seront stockés dans de l'azote liquide jusqu'au traitement. L'ADN sera extrait de tous les échantillons de tissus et l'ARN sera extrait d'échantillons de sang ou de tissus dans des cas sélectionnés. La qualité et la concentration des échantillons seront analysées par spectrophotométrie et fluorométrie. L'ADN sera conservé à -20 °C et l'ARN sera conservé à -80 °C pendant toute la durée de l'étude.

Les échantillons d'ADN seront analysés à l'aide de plusieurs techniques, consistant en une première étape de séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS), suivie d'une hybridation génomique comparative basée sur des puces ciblées (aCGH) et d'un séquençage de l'exome (ES). Pour NGS, un panel personnalisé comprenant 54 gènes ayant une association connue avec les NEN a été conçu, en utilisant la plateforme Twist Biosciences. Des bibliothèques d'ADN sanguin de tous les participants et, lorsque cela est possible, d'ADN tumoral frais, seront préparées selon les instructions du fabricant et séquencées dans un instrument Illumina MiSeq à une profondeur approximative de 300x. Les séquences seront cartographiées sur le génome humain GRCh38/hg38, les doublons PCR seront marqués et l'appel de variantes sera effectué pour les variantes mononucléotidiques (SNV), les indels et les variantes à numéro de copie. Les variantes seront sélectionnées en fonction de leur fréquence (<0,1 % dans les bases de données de la population générale et de la population mexicaine), de leur classification antérieure (selon les directives de l'American College of Medical Genetics and Genomics et de l'Association for Molecular Pathology) rapportées dans ClinVar, des résultats de plusieurs études dans outils de prédiction silico et recherche documentaire pour des données cliniques et expérimentales supplémentaires.

Pour les cas sélectionnés restant sans diagnostic génétique après le panel NGS, une analyse CNV des mêmes régions ciblées sera effectuée. À cette fin, un aCGH haute densité ciblant les mêmes régions d’intérêt que le panel NGS a été conçu, en utilisant la plateforme Agilent SureDesign. Les échantillons seront traités dans un format de matrice 16 x 25 K et les résultats seront analysés avec le logiciel Agilent Genomic Workbench. Le filtrage et la classification des variantes seront effectués de la même manière que celle décrite pour les SNV et les indels.

Toutes les variantes pertinentes classées comme pathogènes et probablement pathogènes seront soumises à une validation orthogonale (séquençage de Sanger pour les SNV et les indels et réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes pour les CNV). Tous les participants choisissant de connaître leurs résultats recevront des rapports détaillés comprenant toutes les variantes pertinentes de signification incertaine (VUS), ainsi que les variantes pathogènes et pathogènes probables avec une interprétation de leur signification clinique. Lorsque cela est cliniquement indiqué, les participants se verront proposer un dépistage ciblé en cascade de membres supplémentaires de la famille. Les VUS sélectionnés, y compris les variantes non signalées précédemment, seront soumis à des évaluations supplémentaires, y compris la recherche de perte d'hétérozygotie dans les tissus tumoraux, des tests d'expression, le séquençage de l'ADN codant et/ou des analyses de points d'arrêt dans le sang et/ou les tissus tumoraux, ou une validation fonctionnelle expérimentale.

Les résultats génétiques seront corrélés aux données cliniques pour déterminer la fréquence et le type de défauts génétiques associés à chaque phénotype dans la population étudiée. À l'inverse, des descriptions cliniques approfondies du répertoire de phénotypes associés à chaque défaut génétique spécifique seront obtenues. L'influence d'associations particulières génotype-phénotype sur la présentation clinique et les résultats cliniques sera également explorée. Les cas sans diagnostic génétique après NGS et aCGH ciblés seront soumis à un séquençage de l'exome. Des groupes de patients présentant des phénotypes similaires seront analysés ensemble pour identifier des défauts spécifiques à la maladie dans les gènes non associés auparavant aux NEN. Les nouvelles associations de candidats seront soigneusement caractérisées à l'aide de combinaisons personnalisées d'approches expérimentales et d'un dépistage supplémentaire dans les familles affectées.

Résultats attendus.

L'incorporation de plusieurs phénotypes de NEN dans la nouvelle plateforme proposée pour le génotypage général améliorera considérablement la probabilité de détection de variantes, par rapport aux tests génétiques actuellement disponibles. En plus de générer une grande quantité de données génétiques et cliniques sur des phénotypes jusqu’alors inexplorés dans la population étudiée, ce projet identifiera très probablement également de nouveaux modificateurs de maladies et variantes fondatrices. Ces données contribueront au développement de stratégies spécifiques à la population et au génotype pour le conseil génétique, le diagnostic précoce, le suivi clinique et le traitement, améliorant ainsi les résultats futurs des personnes atteintes de NEN. Cette stratégie permettra de découvrir le paysage des défauts germinaux et somatiques associés au NEN dans une population extrêmement génétiquement diversifiée et mal représentée dans les études internationales. Les résultats seront comparés aux données d'autres populations pour mieux comprendre les altérations à l'intérieur et à l'extérieur des gènes conducteurs connus qui façonnent les présentations syndromiques, les comportements tumoraux et les modèles de transmission dans les NEN.