Bases genéticas de neoplasias neuroendócrinas em pacientes mexicanos

Introdução.

As NENs são um grupo heterogêneo de neoplasias humanas com comportamento clínico variável, abrangendo desde a indolência até a franca agressividade e malignidade. Eles surgem de vários tecidos com origens embriológicas comuns que compartilham a capacidade de produção de hormônios. Seu crescimento pode comprometer as estruturas circundantes e muitas vezes causam morbidade significativa devido às síndromes associadas de secreção excessiva de hormônios. Embora tradicionalmente considerada rara, a frequência de NENs aumentou muito nas últimas décadas, devido à melhoria da consciência clínica e das estratégias de diagnóstico. Este grupo inclui lesões como NENs broncopulmonares, gastrointestinais, pancreáticas e tímicas, carcinoma medular de tireoide (CMT), paragangliomas e feocromocitomas (PPGLs), adenomas e carcinomas de paratireoide e tumores neuroendócrinos hipofisários (PitNETs), entre outros.

Curiosamente, as NENs estão entre as neoplasias humanas com um componente hereditário mais forte. Alguns NENs fazem parte de síndromes autossômicas dominantes de neoplasia endócrina múltipla, onde se apresentam em combinação com outros tumores endócrinos e não endócrinos característicos no mesmo indivíduo e/ou família. Descrições clínicas de tais entidades existem na literatura desde meados do século XX, embora as suas causas genéticas só tenham sido determinadas há três ou quatro décadas. Em outros casos, um único tipo de tumor, como MTC, PitNETs ou PPGLs, surge em vários membros da mesma família, sem outras características associadas. Ocasionalmente, indivíduos com apresentação aparentemente esporádica são, na verdade, casos simples de condições familiares. Atualmente sabe-se que cerca de 50% dos casos de CMT, 40% de PPGLs, 20% de NENs gastrointestinais, pancreáticas, broncopulmonares e tímicas, 15% de NENs paratireóides e 5-10% de PitNETs são devidos a defeitos da linha germinativa. Além dos defeitos genéticos hereditários, as alterações no nível somático determinam cursos clínicos específicos em NENs esporádicos e familiares.

Na última década, o uso generalizado de ferramentas poderosas para análises genéticas resultou num aumento dramático nas causas genéticas conhecidas de NENs. Essas abordagens também produziram associações genótipo-fenótipo anteriormente insuspeitadas e revelaram uma grande sobreposição na apresentação clínica de diferentes síndromes de neoplasia endócrina múltipla. Os testes genéticos são fundamentais para o diagnóstico precoce, manejo clínico personalizado e aconselhamento genético. Além disso, análises genéticas dos tumores revelaram potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos. No entanto, as plataformas para diagnóstico genético não estão amplamente disponíveis e os dados sobre as causas das doenças genéticas não representam com precisão todas as populações humanas. Os testes genéticos não estão amplamente disponíveis no México e são quase inexistentes nos hospitais públicos, que atendem a maioria dos 128 milhões de habitantes do país. Curiosamente, os mestiços, que representam a maior parte da população mexicana, são um dos grupos humanos com maior diversidade genética. As estratégias de medicina de precisão requerem informações específicas da população, mas os mestiços mexicanos estão pouco representados nas bases de dados genéticas internacionais.

Mira.

Usando uma plataforma de testes precisa, robusta e acessível, este projeto descreverá o repertório e a frequência das causas genéticas germinativas e somáticas de NENs em uma grande coorte prospectiva de mestiços mexicanos. Também definirá os fenótipos e resultados clínicos associados a defeitos genéticos específicos e explorará as consequências funcionais de novos defeitos em genes previamente associados a estas neoplasias. Finalmente, irá descobrir e caracterizar minuciosamente novas associações genéticas, incluindo potenciais alvos drogáveis.

Métodos.

A aprovação do estudo foi obtida dos Conselhos de Ética em Pesquisa de dois hospitais de referência: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, projeto 4090) e Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, projeto R-2022-785-011). Sob consentimento informado, serão obtidas amostras de DNA de sangue e tumores frescos ou fixados em formalina e embebidos em parafina. Todos os métodos experimentais, exceto o sequenciamento do exoma, serão realizados na Rede de Apoio à Pesquisa da Universidade Nacional Autônoma do México e no INCMNSZ. O estudo começou em agosto de 2022 e foi concebido como uma coorte prospectiva de 15 anos com um total estimado de 750 participantes. Indivíduos adultos (idade ≥18 anos no recrutamento) com diagnóstico novo ou anterior de qualquer tipo de NEN serão convidados a participar, incluindo apresentações esporádicas, familiares, isoladas e sindrômicas. Todos os participantes terão a oportunidade de obter os resultados de seus estudos genéticos. Um código único desidentificado será usado para rotular todas as amostras e dados coletados de cada participante, para proteger suas informações pessoais.

Detalhes sobre história familiar, apresentação clínica, estudos bioquímicos, de imagem, histopatológicos e genéticos anteriores para cada participante serão inseridos em um banco de dados clínico eletrônico desidentificado. Os dados sobre os resultados clínicos serão coletados prospectivamente por um período máximo de 15 anos. Para todos os casos, uma amostra de sangue periférico de 5 ml será coletada em tubo com EDTA no recrutamento e armazenada a 4°C até o processamento. O DNA será extraído de amostras de sangue em até 24 horas após a coleta. Amostras de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) serão obtidas para pacientes com ressecção tumoral anterior, quando disponível. Quando possível e sem interferir nas análises histopatológicas de rotina, amostras de tecido fresco congelado serão obtidas de indivíduos submetidos à excisão cirúrgica do tumor no decorrer do estudo. Os tecidos congelados serão armazenados em nitrogênio líquido até o processamento. O DNA será extraído de todas as amostras de tecido e o RNA será extraído de amostras de sangue ou tecido em casos selecionados. A qualidade e concentração da amostra serão analisadas por espectrofotometria e fluorometria. O DNA será armazenado a -20 °C e o RNA será armazenado a -80 °C durante o estudo.

Amostras de DNA serão analisadas usando múltiplas técnicas, consistindo em uma primeira etapa de sequenciamento de próxima geração direcionado (NGS), seguido por hibridização genômica comparativa baseada em array direcionado (aCGH) e sequenciamento de exoma (ES). Para NGS, foi desenhado um painel customizado incluindo 54 genes com associação conhecida com NENs, utilizando a plataforma Twist Biosciences. Bibliotecas de DNA sanguíneo de todos os participantes e, quando possível, DNA tumoral fresco, serão preparadas de acordo com as instruções do fabricante e sequenciadas em um instrumento Illumina MiSeq a uma profundidade aproximada de 300x. As sequências serão mapeadas para o genoma humano GRCh38/hg38, duplicatas de PCR serão marcadas e a chamada de variantes será realizada para variantes de nucleotídeo único (SNVs), indels e variantes de número de cópias. As variantes serão selecionadas com base em sua frequência (<0,1% nos bancos de dados da população geral e da população mexicana), classificação anterior (de acordo com as diretrizes do Colégio Americano de Genética Médica e Genômica e da Associação de Patologia Molecular) relatada no ClinVar, resultados de múltiplos em ferramentas de previsão de silico e pesquisa bibliográfica para dados clínicos e experimentais adicionais.

Para casos selecionados que permanecerem sem diagnóstico genético após o painel NGS, será realizada análise de CNV das mesmas regiões-alvo. Para tanto, foi projetado um aCGH de alta densidade direcionado às mesmas regiões de interesse do painel NGS, utilizando a plataforma Agilent SureDesign. As amostras serão processadas em formato array 16 x 25 K e os resultados serão analisados ​​com o software Agilent Genomic Workbench. A filtragem e classificação de variantes serão feitas de maneira semelhante à descrita para SNVs e indels.

Todas as variantes relevantes classificadas como patogênicas e provavelmente patogênicas serão submetidas à validação ortogonal (sequenciamento Sanger para SNVs e indels e reação em cadeia da polimerase digital por gotículas para CNVs). Todos os participantes que optarem por conhecer seus resultados receberão relatórios detalhados, incluindo todas as variantes relevantes de significado incerto (VUS), bem como prováveis ​​variantes patogênicas e patogênicas com uma interpretação de seu significado clínico. Quando clinicamente indicado, os participantes receberão triagem direcionada em cascata de membros adicionais da família. VUS selecionados, incluindo variantes não relatadas anteriormente, serão submetidos a avaliações adicionais, incluindo pesquisa de perda de heterozigosidade em tecidos tumorais, ensaios de expressão, sequenciamento de DNA codificador e/ou análises de ponto de ruptura em sangue e/ou tecidos tumorais, ou validação funcional experimental.

Os resultados genéticos serão correlacionados com os dados clínicos para determinar a frequência e o tipo de defeitos genéticos associados a cada fenótipo na população de estudo. Por outro lado, serão obtidas descrições clínicas completas do repertório de fenótipos associados a cada defeito genético específico. A influência de associações genótipo-fenótipo específicas na apresentação clínica e nos resultados clínicos também será explorada. Casos sem diagnóstico genético após NGS direcionado e aCGH serão submetidos ao sequenciamento do exoma. Grupos de pacientes com fenótipos semelhantes serão analisados ​​em conjunto para identificar defeitos específicos da doença em genes não previamente associados a NENs. As novas associações candidatas serão minuciosamente caracterizadas usando combinações personalizadas de abordagens experimentais, além de triagem adicional nas famílias afetadas.

Resultados esperados.

A incorporação de múltiplos fenótipos de NENs na nova plataforma proposta para genotipagem geral melhorará significativamente a probabilidade de detecção de variantes, em comparação com os testes genéticos atualmente disponíveis. Além de gerar uma grande quantidade de dados genéticos e clínicos para fenótipos anteriormente inexplorados na população estudada, este projeto provavelmente também identificará novos modificadores de doenças e variantes fundadoras. Estes dados contribuirão para o desenvolvimento de estratégias específicas da população e do genótipo para aconselhamento genético, diagnóstico precoce, acompanhamento clínico e tratamento, melhorando assim os resultados futuros de indivíduos com NENs. Esta estratégia irá revelar o panorama dos defeitos germinativos e somáticos associados à NEN numa população extremamente diversificada geneticamente que está mal representada em estudos internacionais. Os resultados serão comparados com dados de outras populações para compreender melhor as alterações dentro e fora dos genes condutores conhecidos que moldam as apresentações sindrômicas, comportamentos tumorais e padrões de herança em NENs.