Basi genetiche delle neoplasie neuroendocrine nei pazienti messicani

Introduzione.

Le NEN sono un gruppo eterogeneo di neoplasie umane con un comportamento clinico variabile, che va dall'indolenza alla franca aggressività e malignità. Derivano da vari tessuti con origini embriologiche comuni che condividono la capacità di produrre ormoni. La loro crescita potrebbe compromettere le strutture circostanti e spesso causano una significativa morbilità a causa delle sindromi associate da ipersecrezione ormonale. Sebbene tradizionalmente considerata rara, la frequenza delle NEN è notevolmente aumentata negli ultimi decenni, grazie al miglioramento della consapevolezza clinica e delle strategie diagnostiche. Questo gruppo comprende lesioni come NEN broncopolmonari, gastrointestinali, pancreatiche e timiche, carcinoma midollare della tiroide (MTC), paragangliomi e feocromocitomi (PPGL), adenomi e carcinomi paratiroidei e tumori neuroendocrini ipofisari (PitNET), tra gli altri.

È interessante notare che le NEN sono tra le neoplasie umane con una componente ereditaria più forte. Alcune NEN fanno parte di sindromi autosomiche dominanti da neoplasie endocrine multiple, dove si presentano in combinazione con altri tumori endocrini e non endocrini caratteristici nello stesso individuo e/o famiglia. Descrizioni cliniche di tali entità esistono in letteratura sin dalla metà del XX secolo, sebbene le loro cause genetiche non siano state determinate fino a tre o quattro decenni fa. In altri casi, un singolo tipo di tumore, come MTC, PitNET o PPGL, si manifesta in più membri della stessa famiglia, senza altre caratteristiche associate. Occasionalmente, gli individui con presentazione apparentemente sporadica sono in realtà casi semplici di condizioni familiari. È attualmente noto che circa il 50% dei casi di MTC, il 40% di PPGL, il 20% di NEN gastrointestinali, pancreatiche, broncopolmonari e timiche, il 15% di NEN paratiroidee e il 5-10% di PitNET sono dovuti a difetti della linea germinale. A parte i difetti genetici ereditari, le alterazioni a livello somatico determinano decorsi clinici specifici sia nelle NEN sporadiche che familiari.

Nell’ultimo decennio, l’uso diffuso di potenti strumenti per le analisi genetiche ha portato ad un drammatico aumento delle cause genetiche conosciute delle NEN. Questi approcci hanno anche prodotto associazioni genotipo-fenotipo precedentemente insospettate e hanno scoperto una grande sovrapposizione nella presentazione clinica di diverse sindromi di neoplasia endocrina multipla. I test genetici sono fondamentali per la diagnosi precoce, la gestione clinica su misura e la consulenza genetica. Inoltre, le analisi genetiche sui tumori hanno scoperto potenziali biomarcatori e bersagli terapeutici. Tuttavia, le piattaforme per la diagnosi genetica non sono ampiamente disponibili e i dati sulle cause delle malattie genetiche non rappresentano accuratamente tutte le popolazioni umane. I test genetici non sono ampiamente disponibili in Messico e sono quasi inesistenti negli ospedali pubblici, che servono la maggior parte dei circa 128 milioni di abitanti del paese. È interessante notare che i meticci, che rappresentano la maggior parte della popolazione messicana, sono uno dei gruppi umani geneticamente più diversi. Le strategie di medicina di precisione richiedono informazioni specifiche sulla popolazione, tuttavia i meticci messicani sono scarsamente rappresentati nei database genetici internazionali.

Obiettivi.

Utilizzando una piattaforma di test precisa, robusta e conveniente, questo progetto descriverà il repertorio e la frequenza delle cause genetiche germinali e somatiche delle NEN in un'ampia coorte potenziale di meticci messicani. Definirà inoltre i fenotipi e gli esiti clinici associati a specifici difetti genetici ed esplorerà le conseguenze funzionali di nuovi difetti nei geni precedentemente associati a queste neoplasie. Infine, scoprirà e caratterizzerà in modo approfondito nuove associazioni genetiche, compresi potenziali bersagli farmacologici.

Metodi.

L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai comitati di revisione istituzionale di due ospedali di riferimento: Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ, progetto 4090) e Hospital de Especialidades de Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS, progetto R-2022-785-011). Previo consenso informato, verranno ottenuti campioni di DNA da sangue e tumori freschi o fissati in formalina e inclusi in paraffina. Tutti i metodi sperimentali, ad eccezione del sequenziamento dell'esoma, saranno eseguiti presso la rete di supporto alla ricerca dell'Universidad Nacional Autónoma de México e INCMNSZ. Lo studio è iniziato nell’agosto 2022 ed è concepito come una coorte prospettica di 15 anni con un totale stimato di 750 partecipanti. Saranno invitati a partecipare individui adulti (età ≥ 18 anni al momento del reclutamento) con diagnosi nuova o precedente di qualsiasi tipo di NEN, comprese presentazioni sporadiche, familiari, isolate e sindromiche. A tutti i partecipanti verrà offerta l'opportunità di ottenere i risultati dei loro studi genetici. Un codice univoco deidentificato verrà utilizzato per etichettare tutti i campioni e i dati raccolti per ciascun partecipante, per proteggere le sue informazioni personali.

I dettagli sulla storia familiare, la presentazione clinica, gli studi biochimici, di imaging, istopatologici e genetici precedenti per ciascun partecipante verranno inseriti in un database clinico elettronico deidentificato. I dati sugli esiti clinici saranno raccolti in modo prospettico per un massimo di 15 anni. Per tutti i casi, un campione di sangue periferico da 5 ml verrà raccolto in una provetta con EDTA al momento del reclutamento e conservato a 4°C fino al momento del trattamento. Il DNA verrà estratto dai campioni di sangue entro 24 ore dalla raccolta. Verranno ottenuti campioni di tessuto d'archivio fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) per i pazienti con precedente resezione del tumore, quando disponibili. Quando possibile e senza interferire con le analisi istopatologiche di routine, verranno ottenuti campioni di tessuto fresco congelato da individui sottoposti ad asportazione chirurgica del tumore nel corso dello studio. I tessuti congelati verranno conservati in azoto liquido fino al momento della lavorazione. Il DNA verrà estratto da tutti i campioni di tessuto e l'RNA verrà estratto dai campioni di sangue o di tessuto in casi selezionati. La qualità e la concentrazione del campione verranno analizzate mediante spettrofotometria e fluorometria. Il DNA verrà conservato a -20 °C e l'RNA verrà conservato a -80 °C per la durata dello studio.

I campioni di DNA verranno analizzati utilizzando più tecniche, costituite da una prima fase di sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS), seguito dall'ibridazione genomica comparativa mirata basata su array (aCGH) e dal sequenziamento dell'esoma (ES). Per NGS è stato progettato un pannello personalizzato comprendente 54 geni con un'associazione nota con le NEN, utilizzando la piattaforma Twist Biosciences. Le librerie del DNA del sangue di tutti i partecipanti e, quando possibile, del DNA tumorale fresco, verranno preparate secondo le istruzioni del produttore e sequenziate in uno strumento Illumina MiSeq a una profondità approssimativa di 300x. Le sequenze verranno mappate sul genoma umano GRCh38/hg38, i duplicati della PCR verranno marcati e l'identificazione delle varianti verrà effettuata per varianti a singolo nucleotide (SNV), Indel e varianti con numero di copie. Le varianti verranno selezionate in base alla loro frequenza (<0,1% sia nei database della popolazione generale che in quelli della popolazione messicana), alla classificazione precedente (secondo le linee guida dell'American College of Medical Genetics and Genomics e dell'Association for Molecular Pathology) riportata in ClinVar, ai risultati di multipli in strumenti di previsione del silico e ricerca in letteratura di ulteriori dati clinici e sperimentali.

Per i casi selezionati rimasti senza diagnosi genetica dopo il pannello NGS, verrà effettuata l'analisi CNV delle stesse regioni target. A questo scopo, è stato progettato un aCGH ad alta densità mirato alle stesse regioni di interesse del pannello NGS, utilizzando la piattaforma Agilent SureDesign. I campioni verranno elaborati in un formato array 16 x 25 K e i risultati verranno analizzati con il software Agilent Genomic Workbench. Il filtraggio e la classificazione delle varianti verranno eseguiti in modo simile a quanto descritto per SNV e Indel.

Tutte le varianti rilevanti classificate come patogene e probabilmente patogene saranno sottoposte a validazione ortogonale (sequenziamento di Sanger per SNV e Indel e reazione a catena della polimerasi digitale a goccia per CNV). Tutti i partecipanti che scelgono di conoscere i propri risultati riceveranno rapporti dettagliati che includono tutte le varianti rilevanti di significato incerto (VUS), nonché le varianti probabilmente patogene e patogene con un'interpretazione del loro significato clinico. Quando clinicamente indicato, ai partecipanti verrà offerto uno screening mirato a cascata di ulteriori membri della famiglia. I VUS selezionati, comprese le varianti non riportate in precedenza, saranno sottoposti a valutazioni aggiuntive, inclusa la ricerca della perdita di eterozigosi nei tessuti tumorali, test di espressione, sequenziamento del DNA codificante e/o analisi dei breakpoint nel sangue e/o nei tessuti tumorali, o validazione funzionale sperimentale.

I risultati genetici saranno correlati con i dati clinici per determinare la frequenza e il tipo di difetti genetici associati a ciascun fenotipo nella popolazione in studio. Verranno invece ottenute descrizioni cliniche approfondite del repertorio di fenotipi associati a ciascuno specifico difetto genetico. Verrà inoltre esplorata l'influenza di particolari associazioni genotipo-fenotipo sulla presentazione clinica e sui risultati clinici. I casi senza diagnosi genetica dopo NGS mirato e aCGH saranno sottoposti a sequenziamento dell'esoma. Gruppi di pazienti con fenotipi simili verranno analizzati insieme per identificare difetti specifici della malattia in geni non precedentemente associati alle NEN. Le nuove associazioni candidate saranno caratterizzate in modo approfondito utilizzando combinazioni personalizzate di approcci sperimentali oltre a uno screening aggiuntivo nelle famiglie colpite.

Risultati aspettati.

L'incorporazione di più fenotipi di NEN nella nuova piattaforma proposta per la genotipizzazione generale migliorerà significativamente la probabilità di rilevamento delle varianti, rispetto ai test genetici attualmente disponibili. Oltre a generare una grande quantità di dati genetici e clinici per fenotipi precedentemente inesplorati nella popolazione in studio, questo progetto molto probabilmente identificherà anche nuovi modificatori della malattia e varianti del fondatore. Questi dati contribuiranno allo sviluppo di strategie specifiche per popolazione e genotipo per la consulenza genetica, la diagnosi precoce, il follow-up clinico e il trattamento, migliorando così i risultati futuri degli individui affetti da NEN. Questa strategia svelerà il panorama dei difetti germinali e somatici associati alla NEN in una popolazione estremamente diversificata dal punto di vista genetico e scarsamente rappresentata negli studi internazionali. I risultati verranno confrontati con i dati di altre popolazioni per comprendere meglio le alterazioni all'interno e all'esterno dei geni driver noti che modellano le presentazioni sindromiche, i comportamenti tumorali e i modelli di ereditarietà nelle NEN.