結腸直腸がんにおける長い遺伝子間非コードRNA 00511 (LINC00511) の遺伝的変異の影響

1. 導入

   1.1. 背景 結腸直腸がん (CRC) は、エジプトで 7 番目に多いがんです。 世界の大腸がんの負担は、新規感染者数と死亡者数の観点から、2030 年までに 60% 増加すると予想されています。

   放射線療法や化学療法を含む従来の治療法には、さまざまな望ましくない副作用が伴います。 一方、大腸がんの5年生存率は約64%ですが、転移性大腸がんの場合は12%に低下します。 したがって、信頼性が高く正確な予後マーカーの開発が必要です。 長いノンコーディング RNA (lncRNA) は、エピジェネティックなサインである遺​​伝子発現やタンパク質合成の制御を通じて、さまざまな種類のがんにおいて重要な役割を果たしています。

   長い遺伝子間 ncRNA 00511 (LINC00511) は、神経膠腫、卵巣がん、大腸がんなどの多くのがんにおいて発がん機能を発揮する 2265 bp の ncRNA です。 lncRNA の一塩基多型 (SNP) はがんと関連していることがわかっています。 このような遺伝子変異は、SNP の位置に応じてがんのリスクを増加または減少させる可能性があります。 最近、LINC00511 SNP は中国人における乳がん (BC) リスクと関連しており、現在、主任監督者はエジプトの BC における LINC00511 SNP を研究しています。 さらに、まだ研究されていないCRCにおけるLINC00511 SNPの関与に対処することは、CRCの病因を理解し、LINC00511 SNPを疾患の重症度に結び付けるだけでなく、CRCの予防および/または治療の新しい標的を発見するのにも役立つ可能性がある。

   1.2. 研究の目的 LINC00511 SNP (rs17780195 または rs9906859 および rs1558535) と CRC 感受性および/または病因との関連性を調査すること。また、これらの SNP と、組織病理学的タイプ、腫瘍サイズ、リンパ節転移、リンパ節転移などの臨床病理学的因子との相互作用を明らかにすること。腫瘍グレード。

2. 被験者 研究参加者;大きく2つのグループに分類されます

   2.1. グループ I CRC 症例: マンスーラ大学病院から 200 人の CRC 患者が募集され、必要な施設内研究倫理委員会 (REC) 審査委員会の承認を得た後、研究に参加するためのインフォームドコンセントに事前に署名され、サンプルサイズは研究されたのと同じ SNP に従って計算されました。関連する統計手法によると、中国の研究では紀元前での結果が得られました。 除外基準; HBV、住血吸虫症、HIV、アルコール摂取、甲状腺機能障害、炎症性疾患、糖尿病、心血管障害の患者。 化学療法、放射線療法を受けている、またはGIT外科手術を受けた患者、血液疾患疾患、大腸がん以外のがん患者、神経疾患、呼吸器疾患、子宮疾患、腎臓疾患、肝硬変、コルチコステロイドの長期使用患者性ホルモンとか。 さらに、データまたは病理組織学的診断が不完全な患者。

   臨床病理学的基準: 臨床データは医療記録と元の病理学報告書から取得されます。 これらのデータを Excel ファイルにまとめます。 以下の臨床データは、添付の Excel ファイルのように記録および評価されます。

   • すべての参加者について完全な家族歴が記録されます。 - 個人のがん歴と、米国癌合同委員会 (AJCC) の腫瘍リンパ節転移 (TNM) 分類を使用して行われる腫瘍の臨床評価。
   • 肥満指数（BMI）、炎症マーカー、血小板数、CBC、および肝機能検査に関する参加者の特徴 - 決定される癌の組織病理学的タイプ、腫瘍サイズ、および臨床病理学的バイオマーカー癌胎児性抗原 (CEA) および癌腫抗原 19.9 (CA19.9)、 Ki-67 または PCNA (存在する場合) データは、さらなる相関関係と統計分析のために患者ファイルから収集されます。
   • 転移患者のサブグループ（存在する場合、または追跡調査が行われる場合）の治療タイプおよび転移先の部位、無病生存期間（DFS）、全生存期間（OS）、転移後の患者の生存期間治療開始時期は、広く受け入れられている臨床上の利益の直接的な尺度として考慮されます。

   2.2. 対照グループ: 明らかに健康で、年齢と性別が一致し、いかなる病気も患っていず、薬も服用していない 200 人のボランティア。 腎機能および肝酵素レベルが正常で、大腸がんの臨床的または実験室的証拠がない対照被験者は、自分自身またはその親族の定期健康診断検査中に、または慢性疾患スクリーニング国家大統領プログラムから募集されました。

3. 方法論

3.1. インシリコデータベースは以下にアクセスします。

• 国立ヒトゲノム研究所 (NHGRI) の支援を受けた HUGO 遺伝子命名委員会 (HGNC) が報告書を提供しました https://www.genenames.org/ （2022年4月にアクセス）および遺伝子カード識別を使用したLINC00511遺伝子の同定（2022年4月にアクセス）。 さらに、LINC00511 遺伝子発現は、Expression Atlas 種および生物学的条件にわたる遺伝子発現 https://www.ebi の Genotype-Tissue Expression (GTEx) プロジェクトの 53 個のヒト組織サンプルから、データ ユニット TPM を使用した RNA-seq から得られました。 ac.uk/gxa/home (2022 年 1 月 3 日にアクセス)。
• SNP の選択: Han らによる以前の研究に基づく。彼らは、乳がんにおけるいくつかの LINC00511 SNP を、0.05= ≥ 5% を超えるマイナー対立遺伝子頻度 (MAF) についてスクリーニングした後に研究しました。 MAF は、1000 のゲノム データ https://www.ensembl.org/ におけるオープンなヒト変異データをサポートする国際ゲノム サンプル リソース (IGSR) https://www.internationalgenome.org/ から取得されました。 1000GENOMES:フェーズ_3。

SNPinfo Web サーバー http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi にアクセスして、DNA 配列の SNP 情報を取得し、隣接する可能性のある SNP の影響を予測しました。

3.2. 血液サンプリング EDTA 抗凝固剤バキュテナー上で対照および CRC 患者から 5 ml を採取し、アイン シャムス大学薬学部の先端生化学研究室 (ABRL) (研究施設) での生化学的評価まで -80℃ で保存。

3.3. メーカーの指示に従って、QIAmp DNA Blood Mini 抽出キットを使用して 200 μL の全血から血液から DNA を抽出します。 DNA 定量は NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific、英国) によって行われました。

3.4. TaqMan® SNP ジェノタイピング アッセイを使用した SNP ジェノタイピングは、TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific、米国) および StepOnePlus Thermal Cycle (Applied Biosystems、米国) を使用して、LINC00511 SNP (rs17780195、rs9906859、および rs1558535) のジェノタイピングを実行するために使用されます。 ）。

3.5. 統計分析 統計分析は R ソフトウェア (バージョン 4.2.0) で実行されました。 まず、ピアソンのχ 2 カイ二乗検定を使用して、研究された各 SNP の遺伝子型頻度がハーディ・ワインバーグ平衡 (HWE) と一致しているかどうかをチェックしました。

スチューデントの t 検定と χ2 検定をそれぞれ CRC 群と対照群の間の量的変数と質的変数を比較するために使用しました。 人口統計学的要因（年齢、性別、BMI、一親等血縁者のがんの家族歴）を調整した後、無条件ロジスティック回帰を適用して、共優性、優性、過剰性を使用して、検査されたLINC00511 SNP間の大腸がんの独立した危険因子を調査しました。優性および劣性の遺伝子型モデルを比較し、モデルの適合性と予測の尺度 (赤池情報量基準 (AIC)、ベイジアン情報量基準 (BIC)、逸脱情報量基準 (DIC)、擬似 R2 (マクファデンのモデル、コックスとスネルのモデル、およびNagelkerke の))、および受信機下面積動作特性 (AUC) 曲線。 これらの基準に基づくと、相加的/共優勢モデルはすべてのモデルよりも優れていました。 感度 (SN)、特異度 (SP)、陽性的中率 (PPV)、および陰性的中率 (NPV) が、最良の適合性と予測力を持つモデルについて報告されました (単なる疾患診断ではありません)。 LINC00511 SNPの年齢、CA19-9、およびCEA分類の最適なカットオフは、ROC分析を使用して決定されました。 BMI は、過体重および肥満の個人の標準定義に基づいて分類されました (BMI ≥ 25 kg/m2 の被験者は過体重または肥満とみなされます)。 SNP の遺伝子型は、R の snpReady ライブラリを使用して分析されました (Granato et al., 2018) [欠落している遺伝子型はライトの方法 (ライトの平衡に基づく) を使用して代入され、欠落しているベースラインの人口統計データと臨床データは R で実装された予測平均マッチング法を使用して代入されました。 (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn、2011)]。

多重ロジスティック回帰分析を行って、各SNP対立遺伝子、遺伝子型、ハプロタイプ、大腸がんの有病率、病期、悪性度の間の関連性を調べるとともに、ベースラインの共変量（年齢、BMI、腫瘍病期と腫瘍悪性度、患者の追加の危険因子）を調整しました。がんの家族歴、腫瘍部位、IBDの病歴）、古典的腫瘍マーカー（CEAおよびCA19.9）、および血管浸潤の有無。

Firth のロジスティック回帰は、1 つ以上の変数の準分離の場合に実装されました。 Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアバージョン２．０を使用して、異なる遺伝子型のペアワイズＳＮＰ組み合わせブロック間の連鎖不平衡の程度の測定値が、ＳＨＥｓｉｓソフトウェアhttp://analysis.bio-x.cn/myAnaracy.phpを使用して決定されたため、ｒ２およびＤ'を計算した。 層別分析と SHEsis plus オンライン ソフトウェア http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html LINC00511 SNPと大腸がん感受性、および遺伝的分布の測定値としてのハプロタイプ頻度との関連性をさらに評価するために適用され、大腸がんおよび健康な対照群で直接計算されました。 さらに、エピスタシスは、SNP-SNPまたは遺伝子-遺伝子およびSNP-環境または遺伝子-環境相互作用分析を実行するためのR https://ritchielab.org/software/mdr-download のMultifactor Dimensionality Reduction (MDR)パッケージソフトウェアによって分析されました。遺伝的要因と人口統計学的要因の相互作用の役割を評価するために適用されました（偽発見率は、Benjamini と Hochberg、Benjamini と Yekutieli、Holm ステップダウン、Sidak ステップダウン、および Sidak シングルステップ p 値調整を使用して有意水準を調整することによって制御されました）手順）。 MDR 部分に加えて、疑似 R 二乗測定と ROC 曲線による SN、SP、PPV、および NPV を使用してモデルの予測能力を比較すると、LINC00511 SNP の rs 予測に役立ちます。 予測方法 LD 値は、同じサンプル内で特定のウィンドウ内で遺伝子型決定された LINC00511 SNP 間のペアワイズ推定によって計算されました。 確立された方法を使用して、考えられる各ハプロタイプがダブルヘテロ接合体に寄与する割合の最大尤度を推定しました。

患者グループで得られた結果間の差異が偶然ではないことを確認するために、ボンフェローニ計算をデータに適用しました。

最後に、研究者らは、追跡エンドポイントとして死亡日または臨床医との最後の接触日を記録し、CRC患者(n=200)の2年間の全生存期間(OS)を分析した。 無病生存期間（DFS）については、無イベント生存期間（EFS）と同様に、診断時に非転移性大腸がん患者において、再発日または臨床医との最後の接触日が追跡エンドポイントであった。 ノンパラメトリック カプラン マイヤー法 (PROC LIFETEST) を OS 曲線と EFS に対して実行しました。 生存確率計算ツールは、2 つ以上のグループを比較するために、カイ二乗分布を使用したログランク検定を使用して、95% CI のカプラン マイヤー曲線を生成します。

疾患再発の相対リスクはハザード比 (HR) として推定されました。 単変量生存率解析は、性別、MBI、腫瘍部位、がんの家族歴、リンパ節転移、TNM 病期および腫瘍グレードについて、CRC 患者グループおよび LINC00511 SNP 遺伝子型について個別に実施されました。

重要度のレベル。 P ≤ 0.05 の両側値は統計的有意性の兆候とみなされます。