Implicação de variações genéticas no RNA não codificante intergênico longo 00511 (LINC00511) no câncer colorretal

1. Introdução

   1.1. Antecedentes O câncer colorretal (CCR) representa o sétimo câncer mais comum no Egito. Prevê-se que o fardo global da CCR aumente 60%, até 2030, em termos de novos casos e mortes.

   Os tratamentos tradicionais, incluindo radioterapia e quimioterapia, estão associados a vários efeitos colaterais indesejáveis. Enquanto isso, a taxa de sobrevivência em 5 anos para o CCR é de aproximadamente 64%, mas cai para 12% para o CCR metastático. Portanto, é necessário o desenvolvimento de marcadores prognósticos confiáveis ​​e precisos. RNAs não codificantes longos (lncRNAs) desempenham um papel importante em diferentes tipos de câncer através da regulação da expressão gênica, síntese protéica, sendo assinaturas epigenéticas.

   O ncRNA intergênico longo 00511 (LINC00511) é um ncRNA de 2.265 pb que exerce uma função oncogênica em muitos tipos de câncer, como glioma, câncer de ovário e CRC. Descobriu-se que polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em lncRNAs estão associados ao câncer. Tais variantes genéticas podem aumentar ou reduzir o risco de cancro dependendo da localização destes SNPs. Recentemente, os SNPs LINC00511 foram associados ao risco de câncer de mama (BC) na população chinesa e, atualmente, o supervisor-chefe está estudando os SNPs LINC00511 no BC egípcio. Além disso, abordar a implicação dos SNPs LINC00511 no CRC, ainda não estudado, pode ser útil para compreender a patogênese do CRC, ligando os SNPs LINC00511 à gravidade da doença, bem como para descobrir novos alvos para a prevenção e/ou tratamento do CRC.

   1.2. Objetivo do trabalho Investigar a associação entre os SNPs LINC00511 (rs17780195 ou rs9906859 e rs1558535) e a suscetibilidade e/ou patogênese do CRC além de descobrir a interação entre esses SNPs e fatores clinicopatológicos como tipo histopatológico, tamanho do tumor, metástase linfonodal e grau tumoral.

2. Sujeitos Participantes do Estudo; serão classificados em dois grupos principais

   2.1. Casos de CCR do Grupo I: 200 pacientes com CCR foram recrutados em Hospitais Universitários de Mansoura, previamente assinados um consentimento informado para participar do estudo após obter a aprovação necessária do conselho de revisão do comitê de ética em pesquisa institucional (REC). O tamanho da amostra foi calculado de acordo com os mesmos SNPs estudados em BC em um estudo chinês, de acordo com os métodos estatísticos relevantes. Critério de exclusão; pacientes com HBV, esquistossomose, HIV, consumo de álcool, disfunção tireoidiana, doenças inflamatórias, diabetes mellitus e doenças cardiovasculares. Indivíduos que receberam qualquer quimioterapia ou radioterapia, ou que foram submetidos a uma operação cirúrgica do TGI, pacientes com doenças sanguíneas, qualquer câncer que não seja CCR, pacientes com doenças neuronais, doenças respiratórias, doenças uterinas, doenças renais, cirrose hepática, uso prolongado de corticosteróides ou hormônios sexuais. Além disso, pacientes com dados incompletos ou diagnóstico histopatológico.

   Critérios clínico-patológicos: Os dados clínicos serão obtidos dos prontuários médicos e dos laudos patológicos originais. Esses dados devem ser compilados em um arquivo Excel. Os seguintes dados clínicos devem ser registrados e avaliados conforme o arquivo Excel anexo.

   • O histórico familiar completo será registrado para todos os participantes, -Histórico individual de câncer e avaliação clínica do tumor feita usando a classificação tumor-nódulo-metástase (TNM) do American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • As características dos participantes em relação ao índice de massa corporal (IMC), marcador(es) de inflamação, contagem de plaquetas, hemograma completo e testes de função hepática, - Tipo histopatológico de câncer a ser determinado, tamanho do tumor, bem como biomarcadores clínico-patológicos carcinoembrionários antígeno (CEA) e antígeno de carcinoma 19.9 (CA19.9), Os dados Ki-67 ou PCNA (se houver) serão coletados dos arquivos dos pacientes para futuras correlações e análises estatísticas,
   • Para o subgrupo de pacientes metastáticos (se houver, ou se for feito acompanhamento), o tipo de tratamento e o local de destino metastático, a sobrevida livre de doença (SLD), a sobrevida global (SG), a duração da sobrevida do paciente desde o momento do início do tratamento, será considerada uma medida direta de benefício clínico universalmente aceita.

   2.2. Grupo Controle: aparentemente saudáveis, pareados por idade e sexo, 200 voluntários, não portadores de nenhuma doença ou em uso de qualquer medicamento. Indivíduos controle com funções renais e níveis de enzimas hepáticas normais, ausência de qualquer evidência clínica ou laboratorial de CCR, foram recrutados durante exames de rotina para si ou seus familiares ou do Programa Presidencial Nacional de Triagem de Doenças Crônicas.

3. Metodologia

3.1. Acesso in silico a bases de dados:

• O Comitê de Nomenclatura Genética HUGO (HGNC), apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (NHGRI), forneceu um relatório https://www.genenames.org/ (acessado em abril de 2022) e identificação do gene LINC00511 usando identificação de cartão genético (acessado em abril de 2022). Além disso, a expressão do gene LINC00511 foi obtida a partir de RNA-seq usando a unidade de dados TPM, de 53 amostras de tecido humano do Projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) da Expression Atlas Expressão genética entre espécies e condições biológicas https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (acessado em 3 de janeiro de 2022).
• Seleção de SNP: Com base no estudo anterior de Han et al. que estudaram vários SNPs LINC00511 no câncer de mama e após triagem para uma frequência alélica menor (MAF) acima de 0,05 = ≥ 5%. O MAF foi obtido do International Genome Sample Resource (IGSR) Apoiando dados abertos de variação humana https://www.internationalgenome.org/ em dados de 1000 genomas https://www.ensembl.org/ 1000GENOMES:fase_3.

Servidor Web SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi foi acessado para obter informações de SNP na sequência de DNA e para prever um efeito de SNP em potenciais vizinhos.

3.2. Amostragem de sangue 5 ml coletados de controles e pacientes com CCR, em vacutainers anticoagulantes EDTA e armazenados a -80º C, até avaliação bioquímica no Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Avançada (ABRL), Faculdade de Farmácia, Universidade Ain Shams (ambiente de pesquisa).

3.3. Extração de DNA de sangue usando um kit de extração QIAmp DNA Blood Mini de 200 μL de sangue total, de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação do DNA foi realizada pelo NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido).

3.4. A genotipagem de SNPs usando o ensaio de genotipagem TaqMan® SNP será usada para realizar a genotipagem para SNPs LINC00511 (rs17780195, rs9906859 e rs1558535) através do uso do TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, EUA) e StepOnePlus Thermal Cycler (Applied Biosystems, EUA). ).

3.5. Análise estatística A análise estatística foi realizada no software R (versão 4.2.0). Primeiro, as frequências genotípicas para cada SNP estudado foram verificadas em concordância com o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) usando testes χ 2 Qui-quadrado de Pearson.

O teste t de Student e o teste χ2 foram utilizados para comparar variáveis ​​quantitativas e qualitativas entre os grupos CRC e controle, respectivamente. Após ajuste para fatores demográficos (idade, sexo, IMC, histórico familiar de câncer em parentes de primeiro grau), uma regressão logística incondicional aplicada para explorar os fatores de risco independentes para CCR entre os SNPs LINC00511 examinados usando o co-dominante, dominante, over- modelos genotípicos dominantes e recessivos, sendo então comparados usando medidas de ajuste e previsão do modelo (o Critério de Informação de Akaike (AIC), Critério de Informação Bayesiano (BIC), Critério de Informação de Desvio (DIC), Pseudo R2 (McFadden's, Cox e Snell's, e Nagelkerke)) e a curva de características operacionais da área sob o receptor (AUC). O modelo aditivo/codominante foi superior a todos os modelos baseados nestes critérios. Sensibilidade (SN), especificidade (SP), valor preditivo positivo (VPP) e valor predito negativo (VPN) foram relatados para o modelo com melhor ajuste e poder preditivo (não para mero diagnóstico de doença). Os pontos de corte ideais para idade, CA19-9 e categorização CEA dos SNPs LINC00511 foram determinados usando análise ROC. O IMC foi categorizado com base nas definições padrão de indivíduos com sobrepeso e obesidade (indivíduos com IMC ≥ 25 kg/m2 foram considerados com sobrepeso ou obesidade). Os genótipos de SNPs foram analisados ​​usando a biblioteca snpReady em R (Granato et al., 2018) [os genótipos ausentes foram imputados usando o método de Wright (com base no equilíbrio de Wright) e os dados demográficos e clínicos de linha de base ausentes foram imputados usando o método de correspondência média preditiva implementado em R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

A análise de regressão logística múltipla foi feita para examinar a associação entre cada alelo SNP, genótipos, haplótipos e prevalência, estágio e grau de CRC, enquanto ajustava para covariáveis ​​basais (idade, IMC e fatores de risco adicionais para estágio e grau do tumor, pacientes 'história familiar de câncer, local do tumor, história de DII), marcadores tumorais clássicos (CEA e CA19.9) e presença ou ausência de infiltração vascular.

A regressão logística de Firth foi implementada no caso de quase-separação em uma ou mais variáveis. O software Haploview versão 2.0 foi usado para calcular r2 e D', já que as medidas da extensão do desequilíbrio de ligação entre blocos de combinações de SNP pareados de diferentes genótipos foram determinadas usando o software SHEsis //análise.bio-x.cn/myAnalysis.php. Uma análise estratificada e o software online SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html aplicado para avaliar melhor a associação entre os SNPs LINC00511 e a suscetibilidade ao CRC, bem como a frequência de haplótipos, já que uma medida da distribuição genética foi calculada diretamente no CRC e em grupos de controle saudáveis. Além disso, a Epistasia foi analisada pelo software do pacote Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) em R https://ritchielab.org/software/mdr-download para realizar SNP-SNP ou gene-gene e SNP-Environment ou análise de interação gene-ambiente, aplicado para avaliar o papel interativo de fatores genéticos e demográficos (a taxa de descoberta falsa foi controlada ajustando o nível de significância usando Benjamini e Hochberg, Benjamini e Yekutieli, redução de Holm, redução de Sidak e ajuste de valor p de etapa única de Sidak procedimentos). Ao comparar a capacidade preditiva dos modelos utilizando as medidas pseudo-R-quadrado e a curva SN, SP, PPV e NPV por ROC, além da parte MDR, auxilia na predição de rs dos SNPs LINC00511. Os valores de LD do método de predição foram calculados por uma estimativa pareada entre SNPs LINC00511 genotipados na mesma amostra e dentro de uma determinada janela. Um método estabelecido foi utilizado para estimar a probabilidade máxima da proporção em que cada haplótipo possível contribuiu para o duplo heterozigoto.

Para confirmar que as diferenças entre os resultados obtidos no grupo de pacientes não foram por acaso, um cálculo de Bonferroni foi aplicado aos dados.

Finalmente, os investigadores analisaram a sobrevivência global (SG) durante 2 anos nos pacientes com CCR (n=200) com registo da data da morte ou do último contacto com o médico como ponto final do acompanhamento. Para a sobrevida livre de doença (SLD), assim como a sobrevida livre de eventos (SLE), em pacientes com CCR não metastático no momento do diagnóstico, a data da recidiva ou do último contato com o médico foi o desfecho do acompanhamento. O método não paramétrico de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST) foi realizado para curvas OS e EFS. A calculadora de probabilidade de sobrevivência gera a curva de Kaplan-Meier com IC 95%, utilizando o teste log-rank utilizando a distribuição Qui-quadrado, para comparação de mais de dois grupos.

O risco relativo de recidiva da doença foi estimado como razão de risco (HR). Análises de sobrevida univariadas foram feitas para gênero, MBI, local do tumor, história familiar de câncer, envolvimento linfonodal, estágio TNM e graus tumorais separadamente, para o grupo de pacientes com CCR, bem como para os genótipos de SNPs LINC00511.

Nível de significância. Um valor bilateral de P ≤ 0,05 foi considerado um sinal de significância estatística.