Implikasjon av genetiske variasjoner i lang intergenisk ikke-kodende RNA 00511 (LINC00511) i kolorektal kreft

1. Introduksjon

   1.1. Bakgrunn Kolorektal kreft (CRC) representerer den 7. vanligste kreftformen i Egypt. Den globale byrden av CRC forventes å øke med 60 % innen 2030 når det gjelder nye tilfeller og dødsfall.

   Tradisjonelle behandlinger inkludert radio- og kjemoterapi er assosiert med ulike uønskede bivirkninger. I mellomtiden er 5-års overlevelsesraten for CRC ~ 64%, men synker til 12% for metastatisk CRC. Derfor er utvikling av pålitelige og nøyaktige prognostiske markører nødvendig. Lange ikke-kodende RNA (lncRNA) spiller en viktig rolle i ulike typer kreft gjennom regulering av genuttrykk, proteinsyntese, som er epigenetiske signaturer.

   Long intergenic ncRNA 00511 (LINC00511) er et 2265 bp ncRNA som utøver en onkogen funksjon i mange kreftformer, som gliom, eggstokkreft og CRC. Enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP-er) i lncRNA-er har vist seg å være assosiert med kreft. Slike genetiske varianter kan øke eller redusere risikoen for kreft avhengig av plasseringen av disse SNP-ene. Nylig ble LINC00511 SNP-er assosiert med risiko for brystkreft (BC) i den kinesiske befolkningen, og for tiden studerer hovedveilederen LINC00511 SNP-er i egyptisk BC. Dessuten, for å adressere implikasjonen av LINC00511 SNP-er i CRC, som ikke er studert ennå, kan det være nyttig for å forstå CRC-patogenesen, koble LINC00511 SNP-er til sykdommens alvorlighetsgrad, samt for å oppdage nye mål for CRC-forebygging og/eller behandling.

   1.2. Målet med arbeidet Undersøkelse av sammenhengen mellom LINC00511 SNP (rs17780195 eller rs9906859 og rs1558535) og CRC-mottakelighet og/eller patogenese i tillegg til å finne ut interaksjonen mellom disse SNP-ene og klinikopatologiske typer, som f.eks. svulstgrad.

2. Emner Studie Deltakere; vil bli klassifisert i to hovedgrupper

   2.1. Gruppe I CRC-tilfeller: 200 CRC-pasienter ble rekruttert fra Mansoura University Hospitals, som tidligere har signert et informert samtykke til å delta i studien etter å ha oppnådd den nødvendige godkjenningen fra institusjonell forskningsetisk komité (REC) review board. Prøvestørrelsen ble beregnet i henhold til de samme SNP-ene som ble studert i BC i en kinesisk studie, i henhold til relevante statistiske metoder. Eksklusjonskriterier; pasienter med HBV, schistosomiasis, HIV, alkoholinntak, skjoldbrusk dysfunksjon, inflammatoriske sykdommer, diabetes mellitus og kardiovaskulære lidelser. Personer som får cellegift eller strålebehandling, eller har gjennomgått en GIT-kirurgi, pasienter med blodsykdommer, annen kreft enn CRC, pasienter med nevronale sykdommer, luftveissykdommer, livmorsykdommer, nyresykdommer, levercirrhose, langvarig bruk av kortikosteroider eller kjønnshormoner. I tillegg pasienter med ufullstendige data eller histopatologisk diagnose.

   Klinisk-patologiske kriterier: Kliniske data vil bli innhentet fra medisinske journaler og de originale patologirapportene. Disse dataene skal kompileres i en excel-fil. Følgende kliniske data skal registreres og vurderes som i den vedlagte excel-filen.

   • Full familiehistorie vil bli registrert for alle deltakere, -Individuell krefthistorie og den kliniske tumorvurderingen gjort ved bruk av tumor-node-metastasis (TNM) klassifiseringen av American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • Karakteristikkene til deltakerne med hensyn til kroppsmasseindeks (BMI), betennelsesmarkør(er), antall blodplater, CBC og leverfunksjonstester, -Cancer histopatologisk type som skal bestemmes, tumorstørrelse, samt klinisk-patologiske biomarkører karsinoembryonale antigen (CEA) og karsinomantigen 19.9 (CA19.9), Ki-67 eller PCNA (hvis noen) data vil bli samlet inn fra pasientfiler for ytterligere korrelasjoner og statistisk analyse,
   • For de metastatiske pasientenes undergruppe (hvis noen, eller hvis oppfølging vil bli gjort) behandlingstype og stedet for metastatisk destinasjon, sykdomsfri overlevelse (DFS), total overlevelse (OS), varigheten av pasientens overlevelse fra tidspunkt for behandlingsstart, vil bli betraktet som et universelt akseptert direkte mål på klinisk nytte.

   2.2. Kontrollgruppe: tilsynelatende frisk, alder og kjønn matchet, 200 frivillige, som ikke lider av noen sykdom eller tar noen medisiner. Kontrollpersoner med normal nyrefunksjon og leverenzymnivåer, fravær av kliniske eller laboratoriebevis for CRC, ble rekruttert under rutinemessige kontrollundersøkelser for seg selv eller deres slektninger eller fra Chronic Diseases Screening National Presidential Program.

3. Metodikk

3.1. I silico-databaser tilgang:

• HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) støttet av National Human Genome Research Institute (NHGRI) ga en rapport https://www.genenames.org/ (åpnet april 2022) og identifikasjon av LINC00511-genet ved bruk av genkortidentifikasjon (åpnet april 2022). I tillegg ble LINC00511 genuttrykk hentet fra RNA-seq ved bruk av dataenhet TPM, fra 53 humane vevsprøver fra Genotype-Tissue Expression (GTEx) Project fra Expression Atlas Genuttrykk på tvers av arter og biologiske forhold https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (åpnet 3. januar 2022).
• SNP-utvalg: Basert på forrige studie av Han et al. som studerte flere LINC00511 SNP-er i brystkreft og etter screening for en mindre allelfrekvens (MAF) over 0,05= ≥ 5 %. MAF ble hentet fra International Genome Sample Resource (IGSR) som støtter åpne menneskelige variasjonsdata https://www.internationalgenome.org/ i 1000 genomdata https://www.ensembl.org/ 1000GENOMES:fase_3.

SNPinfo Web Server http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi ble åpnet for å få SNP-informasjon i DNA-sekvens og for å forutsi en SNP-effekt på potensielle naboer.

3.2. Blodprøvetaking 5 ml tatt fra kontroller og CRC-pasienter, på EDTA antikoagulerende vacutainere og lagret ved -80ºC, frem til biokjemisk vurdering ved Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Farmasøytisk fakultet, Ain Shams University (forskningsmiljø).

3.3. DNA-ekstraksjon fra blod ved hjelp av et QIAmp DNA Blood Mini-ekstraksjonssett fra 200 μL fullblod, i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-kvantifisering ble utført av NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Storbritannia).

3.4. SNP-er Genotyping ved hjelp av TaqMan® SNP-genotypingsanalyse vil bli brukt til å utføre genotyping for LINC00511 SNP-er (rs17780195, rs9906859 og rs1558535) ved å bruke TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) og StepOnemal Scientific, USA ).

3.5. Statistisk analyse Den statistiske analysen ble utført i R-programvare (versjon 4.2.0). Først ble genotypefrekvenser for hver studert SNP kontrollert for å være i samsvar med Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) ved å bruke Pearsons χ 2 Chi-kvadrat-tester.

Studentens t-test og χ2-testen ble brukt til å sammenligne kvantitative og kvalitative variabler mellom henholdsvis CRC- og kontrollgruppene. Etter justering for demografiske faktorer (alder, kjønn, BMI, familiehistorie med kreft hos førstegradsslektninger), ble en ubetinget logistisk regresjon brukt for å utforske de uavhengige risikofaktorene for CRC blant de undersøkte LINC00511 SNP-ene ved å bruke de co-dominante, dominante, over- dominante og recessive genotypiske modeller, og sammenlignes deretter ved å bruke mål på modelltilpasning og prediksjon (Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFadden's, Cox og Snell's, og Nagelkerke's)), og areal-under-mottaker operasjonskarakteristikk (AUC) kurve. Den additive/co-dominante modellen var overlegen alle modeller basert på disse kriteriene. Sensitivitet (SN), spesifisitet (SP), positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) ble rapportert for modellen med best tilpasning og prediktiv kraft (ikke for ren sykdomsdiagnose). De optimale grensene for alder, CA19-9 og CEA-kategorisering av LINC00511 SNP-er ble bestemt ved hjelp av ROC-analyse. BMI ble kategorisert basert på standarddefinisjonene av overvektige og overvektige individer (personer med BMI ≥ 25 kg/m2 ble ansett som overvektige eller overvektige). SNP-genotyper ble analysert ved å bruke snpReady-biblioteket i R (Granato et al., 2018) [manglende genotyper ble imputert ved bruk av Wrights metode (basert på Wrights likevekt) og manglende demografiske og kliniske data fra grunnlinjen ble imputert ved bruk av den prediktive gjennomsnittsmatchingsmetoden implementert i R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Multippel logistisk regresjonsanalyse ble gjort for å undersøke sammenhengen mellom hver SNP-alleler, genotyper, haplotyper og CRC-prevalens, stadium og grad, mens det ble justert for baseline-kovariater (alder, BMI og ytterligere risikofaktorer for tumorstadium og tumorgrad, pasienter) ' kreftfamiliehistorie, tumorsted, historie med IBD), klassiske tumormarkører (CEA og CA19.9), og tilstedeværelse eller fravær av vaskulær infiltrasjon.

Firths logistiske regresjon ble implementert i tilfelle av kvasi-separasjon i en eller flere variabler. Haploview programvareversjon 2.0 ble brukt til å beregne r2 og D' ettersom målingene av koblingsulikevektsgrad mellom parvise SNP-kombinasjoner blokker av forskjellige genotyper ble bestemt ved å bruke SHEsis-programvaren http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. En stratifisert analyse og SHEsis pluss nettbaserte programvare http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html brukt for ytterligere å evaluere assosiasjonen mellom LINC00511 SNP-er og CRC-følsomhet samt haplotypefrekvens som en måling av genetisk distribusjon ble direkte beregnet i CRC og friske kontrollgrupper. Videre ble epistase analysert av Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) pakkeprogramvare i R https://ritchielab.org/software/mdr-download for å utføre SNP-SNP eller gen-gen og SNP-Environment eller gen-miljø interaksjonsanalyse, brukt for å evaluere den interaktive rollen til genetiske og demografiske faktorer (falsk oppdagelsesrate ble kontrollert ved å justere signifikansnivået ved å bruke Benjamini og Hochberg, Benjamini og Yekutieli, Holm step-down, Sidak step-down og Sidak enkelttrinns p-verdijustering prosedyrer). Når man sammenligner prediksjonsevnen til modellene ved å bruke pseudo-R-kvadrerte mål og SN, SP, PPV og NPV by ROC-kurven, i tillegg til MDR-delen, hjelper det for LINC00511 SNPs rs-prediksjon. Prediksjonsmetode LD-verdier ble beregnet ved en parvis estimering mellom LINC00511 SNP-er genotypet i samme prøve og innenfor et gitt vindu. En etablert metode ble brukt for å estimere den maksimale sannsynligheten for andelen som hver mulig haplotype bidro til den doble heterozygoten.

For å bekrefte at forskjeller mellom oppnådde resultater i pasientgruppen ikke var tilfeldig, ble en Bonferroni-beregning brukt på dataene.

Til slutt analyserte etterforskerne den totale overlevelsen (OS) i 2 år hos CRC-pasientene (n=200) med registrering av dødsdato eller siste kontakt med klinikeren som oppfølgingsendepunkt. For sykdomsfri overlevelse (DFS), som hendelsesfri overlevelse (EFS), hos pasienter med ikke-metastatisk CRC på diagnosetidspunktet, var dato for tilbakefall eller siste kontakt med legen oppfølgingsendepunktet. Den ikke-parametriske Kaplan-Meier-metoden (PROC LIFETEST) ble utført for OS-kurver og EFS. Overlevelsessannsynlighetskalkulatoren genererer Kaplan-Meier-kurven med 95 % CI, ved å bruke log-rank test ved bruk av Chi-kvadratfordelingen, for sammenligning av mer enn to grupper.

Den relative risikoen for tilbakefall av sykdom ble estimert som hazard ratio (HR). Univariable overlevelsesanalyser ble gjort for kjønn, MBI, tumorsted, familiehistorie med kreft, lymfeknuteinvolvering, TNM-stadium og tumorgrader separat, for CRC-pasientgruppen så vel som for LINC00511 SNPs genotyper.

Nivå av betydning. En tosidig verdi på P ≤ 0,05 ble ansett som et tegn på statistisk signifikans.