Bedeutung genetischer Variationen in der langen intergenen nichtkodierenden RNA 00511 (LINC00511) bei Darmkrebs

1. Einführung

   1.1. Hintergrund Darmkrebs (CRC) ist die siebthäufigste Krebsart in Ägypten. Es wird erwartet, dass die weltweite Belastung durch Darmkrebs bis zum Jahr 2030 in Bezug auf neue Fälle und Todesfälle um 60 % zunehmen wird.

   Traditionelle Behandlungen, einschließlich Radio- und Chemotherapien, sind mit verschiedenen unerwünschten Nebenwirkungen verbunden. Mittlerweile liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei Darmkrebs bei etwa 64 %, bei metastasiertem Darmkrebs sinkt sie jedoch auf 12 %. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger und genauer Prognosemarker erforderlich. Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) spielen bei verschiedenen Krebsarten eine wichtige Rolle, indem sie die Genexpression und Proteinsynthese regulieren und epigenetische Signaturen darstellen.

   Die lange intergene ncRNA 00511 (LINC00511) ist eine 2265 bp große ncRNA, die bei vielen Krebsarten wie Gliom, Eierstockkrebs und Darmkrebs eine onkogene Funktion ausübt. Es wurde festgestellt, dass Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in lncRNAs mit Krebs assoziiert sind. Solche genetischen Varianten können je nach Standort dieser SNPs das Krebsrisiko erhöhen oder verringern. Kürzlich wurden LINC00511-SNPs mit dem Brustkrebsrisiko (BC) in der chinesischen Bevölkerung in Verbindung gebracht, und derzeit untersucht der Chefarzt LINC00511-SNPs im ägyptischen BC. Darüber hinaus könnte die Untersuchung der noch nicht untersuchten Bedeutung von LINC00511-SNPs bei CRC hilfreich sein, um die Pathogenese von CRC zu verstehen, LINC00511-SNPs mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung zu bringen und neue Ziele für die CRC-Prävention und/oder -Behandlung zu entdecken.

   1.2. Ziel der Arbeit Untersuchung des Zusammenhangs zwischen LINC00511-SNPs (rs17780195 oder rs9906859 und rs1558535) und CRC-Anfälligkeit und/oder Pathogenese sowie Ermittlung der Wechselwirkung zwischen diesen SNPs und klinisch-pathologischen Faktoren wie histopathologischem Typ, Tumorgröße, Lymphknotenmetastasierung usw Tumorgrad.

2. Themen Studienteilnehmer; werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt

   2.1. CRC-Fälle der Gruppe I: 200 CRC-Patienten wurden aus Universitätskliniken von Mansoura rekrutiert und unterzeichneten zuvor eine Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie, nachdem sie die erforderliche Genehmigung des Prüfungsausschusses des Institutional Research Ethics Committee (REC) erhalten hatten. Die Stichprobengröße wurde anhand derselben untersuchten SNPs berechnet in BC in einer chinesischen Studie nach den einschlägigen statistischen Methoden. Ausschlusskriterien; Patienten mit HBV, Schistosomiasis, HIV, Alkoholkonsum, Schilddrüsenfunktionsstörungen, entzündlichen Erkrankungen, Diabetes mellitus und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Probanden, die eine Chemotherapie oder Strahlentherapie erhalten oder sich einem chirurgischen Eingriff im Magen-Darm-Trakt unterzogen haben, Patienten mit Blutkrankheiten, anderen Krebsarten als CRC, Patienten mit neuronalen Erkrankungen, Atemwegserkrankungen, Gebärmuttererkrankungen, Nierenerkrankungen, Leberzirrhose, längerer Anwendung von Kortikosteroiden oder Sexualhormone. Darüber hinaus Patienten mit unvollständigen Daten oder unvollständiger histopathologischer Diagnose.

   Klinisch-pathologische Kriterien: Klinische Daten werden aus medizinischen Unterlagen und den ursprünglichen Pathologieberichten entnommen. Diese Daten werden in einer Excel-Datei zusammengestellt. Die folgenden klinischen Daten sind gemäß der beigefügten Excel-Datei zu erfassen und auszuwerten.

   • Für alle Teilnehmer wird die vollständige Familienanamnese erfasst. - Die individuelle Krebsanamnese und die klinische Beurteilung des Tumors erfolgen anhand der Tumor-Knoten-Metastasen-Klassifikation (TNM) des American Joint Committee on Cancer (AJCC).
   • Die Merkmale der Teilnehmer in Bezug auf Body-Mass-Index (BMI), Entzündungsmarker, Thrombozytenzahl, Blutbild und Leberfunktionstests, zu bestimmender histopathologischer Krebstyp, Tumorgröße sowie klinisch-pathologische Biomarker karzinoembryonal Antigen (CEA) und Karzinomantigen 19.9 (CA19.9), Ki-67- oder PCNA-Daten (falls vorhanden) werden aus Patientenakten für weitere Korrelationen und statistische Analysen gesammelt.
   • Für die Untergruppe der metastasierten Patienten (falls vorhanden oder wenn Nachuntersuchungen durchgeführt werden) Behandlungstyp und Ort des Metastasierungsziels, krankheitsfreies Überleben (DFS), Gesamtüberleben (OS), die Dauer des Patientenüberlebens ab dem Der Zeitpunkt des Behandlungsbeginns wird als allgemein anerkannter direkter Maßstab für den klinischen Nutzen angesehen.

   2.2. Kontrollgruppe: augenscheinlich gesund, gleiches Alter und Geschlecht, 200 Freiwillige, die an keiner Krankheit leiden und keine Medikamente einnehmen. Kontrollpersonen mit normaler Nierenfunktion und Leberenzymwerten, bei denen kein klinischer oder laborchemischer Nachweis von Darmkrebs vorlag, wurden im Rahmen routinemäßiger Kontrolluntersuchungen für sich selbst oder ihre Verwandten oder im Rahmen des National Presidential Program zur Früherkennung chronischer Krankheiten rekrutiert.

3. Methodik

3.1. Zugriff auf In-silico-Datenbanken:

• Das HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC), unterstützt vom National Human Genome Research Institute (NHGRI), stellte einen Bericht zur Verfügung: https://www.genenames.org/ (abgerufen im April 2022) und Identifizierung des Gens LINC00511 mithilfe der Genkartenidentifizierung (abgerufen im April 2022). Darüber hinaus wurde die Genexpression von LINC00511 aus RNA-seq unter Verwendung der Dateneinheit TPM aus 53 menschlichen Gewebeproben aus dem Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Projekt des Expression Atlas erhalten. Genexpression über Arten und biologische Bedingungen hinweg https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (abgerufen am 3. Januar 2022).
• SNP-Auswahl: Basierend auf der vorherigen Studie von Han et al. die mehrere LINC00511-SNPs bei Brustkrebs und nach einem Screening auf eine Minor-Allel-Häufigkeit (MAF) über 0,05 = ≥ 5 % untersuchten. MAF wurde von der International Genome Sample Resource (IGSR) bezogen und unterstützt offene menschliche Variationsdaten https://www.internationalgenome.org/ in 1000 Genomdaten https://www.ensembl.org/ 1000GENOME:phase_3.

SNPinfo-Webserver http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- Auf bin/snpinfo/snpfunc.cgi wurde zugegriffen, um SNP-Informationen in der DNA-Sequenz zu erhalten und einen SNP-Effekt auf potenzielle Nachbarn vorherzusagen.

3.2. 5 ml Blutprobe, entnommen von Kontrollpersonen und CRC-Patienten, auf EDTA-Antikoagulans-Vakutainern, gelagert bei -80 °C, bis zur biochemischen Bewertung im Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Fakultät für Pharmazie, Ain Shams University (Forschungsumgebung).

3.3. DNA-Extraktion aus Blut mit einem QIAmp DNA Blood Mini-Extraktionskit aus 200 μL Vollblut gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die DNA-Quantifizierung wurde mit NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, UK) durchgeführt.

3.4. Die Genotypisierung von SNPs mit dem TaqMan® SNP-Genotypisierungstest wird verwendet, um die Genotypisierung für LINC00511-SNPs (rs17780195, rs9906859 und rs1558535) mithilfe des TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) und des StepOnePlus Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA) durchzuführen ).

3.5. Statistische Analyse Die statistische Analyse wurde in der R-Software (Version 4.2.0) durchgeführt. Zunächst wurde überprüft, ob die Genotyphäufigkeiten für jeden untersuchten SNP mit dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) übereinstimmen, indem Pearsons χ 2 Chi-Quadrat-Tests verwendet wurden.

Der Student-T-Test und der χ2-Test wurden verwendet, um quantitative und qualitative Variablen zwischen der CRC- bzw. der Kontrollgruppe zu vergleichen. Nach Anpassung an demografische Faktoren (Alter, Geschlecht, BMI, Familiengeschichte von Krebs bei Verwandten ersten Grades) wurde eine bedingungslose logistische Regression angewendet, um die unabhängigen Risikofaktoren für CRC unter den untersuchten LINC00511-SNPs unter Verwendung der kodominanten, dominanten, über- dominante und rezessive genotypische Modelle, die dann mithilfe von Maßen für die Modellanpassung und -vorhersage verglichen werden (Akaike-Informationskriterium (AIC), Bayesianisches Informationskriterium (BIC), Abweichungsinformationskriterium (DIC), Pseudo-R2 (McFaddens, Cox und Snells usw.). Nagelkerke's)) und die Area-under-Receiver Operating Characteristics (AUC)-Kurve. Basierend auf diesen Kriterien war das additive/kodominante Modell allen Modellen überlegen. Sensitivität (SN), Spezifität (SP), positiver Vorhersagewert (PPV) und negativer Vorhersagewert (NPV) wurden für das Modell mit der besten Anpassung und Vorhersagekraft angegeben (nicht für die bloße Krankheitsdiagnose). Die optimalen Grenzwerte für Alter, CA19-9 und CEA-Kategorisierung von LINC00511-SNPs wurden mithilfe der ROC-Analyse ermittelt. Der BMI wurde auf der Grundlage der Standarddefinitionen für übergewichtige und fettleibige Personen kategorisiert (Personen mit einem BMI ≥ 25 kg/m2 galten als übergewichtig oder fettleibig). SNPs-Genotypen wurden mithilfe der snpReady-Bibliothek in R analysiert (Granato et al., 2018) [Fehlende Genotypen wurden mithilfe der Wright-Methode (basierend auf Wrights Gleichgewicht) unterstellt, und fehlende demografische und klinische Basisdaten wurden mithilfe der in R implementierten prädiktiven Mittelwert-Matching-Methode unterstellt (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Es wurde eine multiple logistische Regressionsanalyse durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen den einzelnen SNP-Allelen, Genotypen, Haplotypen und der CRC-Prävalenz, dem Stadium und dem Grad zu untersuchen, wobei die Basiskovariaten (Alter, BMI und zusätzliche Risikofaktoren für Tumorstadium und Tumorgrad, Patienten) berücksichtigt wurden ' Krebsfamilienanamnese, Tumorlokalisation, Vorgeschichte von IBD), klassische Tumormarker (CEA und CA19.9) und das Vorhandensein oder Fehlen einer Gefäßinfiltration.

Die logistische Regression von Firth wurde im Fall einer Quasi-Trennung in einer oder mehreren Variablen implementiert. Zur Berechnung von r2 und D' wurde die Haploview-Software Version 2.0 verwendet, da die Messungen des Ausmaßes des Kopplungsungleichgewichts zwischen paarweisen SNP-Kombinationsblöcken verschiedener Genotypen mit der SHEsis-Software http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php ermittelt wurden. Eine geschichtete Analyse und die Online-Software SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html zur weiteren Bewertung des Zusammenhangs zwischen LINC00511-SNPs und CRC-Anfälligkeit sowie der Häufigkeit von Haplotypen als Maß für die genetische Verteilung wurde direkt in CRC- und gesunden Kontrollgruppen berechnet. Darüber hinaus wurde Epistasis mit der Multifactor Dimensionality Reduction (MDR)-Paketsoftware in R https://ritchielab.org/software/mdr-download analysiert, um eine SNP-SNP- oder Gen-Gen- und SNP-Umwelt- oder Gen-Umwelt-Interaktionsanalyse durchzuführen. angewendet, um die interaktive Rolle genetischer und demografischer Faktoren zu bewerten (die Rate falscher Entdeckungen wurde durch Anpassen des Signifikanzniveaus mithilfe der Benjamini- und Hochberg-, Benjamini- und Yekutieli-, Holm-Step-Down-, Sidak-Step-Down- und Sidak-einstufigen p-Wert-Anpassung gesteuert). Verfahren). Beim Vergleich der Vorhersagefähigkeit der Modelle unter Verwendung der Pseudo-R-Quadrat-Messungen und der SN-, SP-, PPV- und NPV-nach-ROC-Kurve sowie des MDR-Teils sind dies hilfreiche Ergebnisse für die RS-Vorhersage von LINC00511 SNPs. Die LD-Werte der Vorhersagemethode wurden durch eine paarweise Schätzung zwischen LINC00511-SNPs berechnet, die in derselben Probe und innerhalb eines bestimmten Fensters genotypisiert wurden. Eine etablierte Methode wurde verwendet, um die maximale Wahrscheinlichkeit des Anteils abzuschätzen, den jeder mögliche Haplotyp zur doppelten Heterozygote beitrug.

Um zu bestätigen, dass Unterschiede zwischen den erhaltenen Ergebnissen in der Patientengruppe nicht zufällig waren, wurde eine Bonferroni-Berechnung auf die Daten angewendet.

Abschließend analysierten die Forscher das Gesamtüberleben (OS) für 2 Jahre bei den CRC-Patienten (n=200) und zeichneten dabei das Sterbedatum oder den letzten Kontakt mit dem Kliniker als Endpunkt der Nachuntersuchung auf. Für das krankheitsfreie Überleben (DFS) als ereignisfreies Überleben (EFS) war bei Patienten mit nicht metastasiertem Darmkrebs zum Zeitpunkt der Diagnose das Datum des Rückfalls oder der letzte Kontakt mit dem Arzt der Endpunkt der Nachuntersuchung. Für OS-Kurven und EFS wurde die nichtparametrische Kaplan-Meier-Methode (PROC LIFETEST) durchgeführt. Der Überlebenswahrscheinlichkeitsrechner generiert die Kaplan-Meier-Kurve mit 95 % KI unter Verwendung des Log-Rank-Tests unter Verwendung der Chi-Quadrat-Verteilung zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen.

Das relative Risiko eines Krankheitsrückfalls wurde als Hazard Ratio (HR) geschätzt. Univariable Überlebensanalysen wurden für Geschlecht, MBI, Tumorlokalisation, Familienanamnese von Krebs, Lymphknotenbefall, TNM-Stadium und Tumorgrade separat durchgeführt, sowohl für die CRC-Patientengruppe als auch für LINC00511-SNPs-Genotypen.

Signifikanzniveau. Ein zweiseitiger Wert von P ≤ 0,05 wurde als Zeichen statistischer Signifikanz gewertet.