Значение генетических вариаций длинной межгенной некодирующей РНК 00511 (LINC00511) при колоректальном раке

1. Введение

   1.1. Введение Колоректальный рак (КРР) занимает 7-е место среди наиболее распространенных видов рака в Египте. Ожидается, что к 2030 году глобальное бремя КРР увеличится на 60% с точки зрения новых случаев и смертей.

   Традиционные методы лечения, включая радио- и химиотерапию, связаны с различными нежелательными побочными эффектами. Между тем, 5-летняя выживаемость при КРР составляет ~ 64%, но падает до 12% при метастатическом КРР. Поэтому необходима разработка надежных и точных прогностических маркеров. Длинные некодирующие РНК (днРНК) играют важную роль при различных типах рака посредством регуляции экспрессии генов, синтеза белка, являясь эпигенетическими сигнатурами.

   Длинная межгенная нкРНК 00511 (LINC00511) представляет собой нкРНК длиной 2265 п.н., которая оказывает онкогенную функцию при многих видах рака, таких как глиома, рак яичников и КРР. Было обнаружено, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в lncRNAs связаны с раком. Такие генетические варианты могут увеличивать или уменьшать риск развития рака в зависимости от местоположения этих SNP. Недавно SNP LINC00511 были связаны с риском рака молочной железы (РМЖ) у населения Китая, и в настоящее время главный научный руководитель изучает SNP LINC00511 в египетской Британской Колумбии. Более того, изучение влияния SNP LINC00511 на CRC, которое еще не изучено, может быть полезно для понимания патогенеза CRC, связи SNP LINC00511 с тяжестью заболевания, а также для открытия новой цели для профилактики и/или лечения CRC.

   1.2. Цель работы: Исследование связи между SNP LINC00511 (rs17780195 или rs9906859 и rs1558535) и чувствительностью и/или патогенезом CRC в дополнение к выяснению взаимодействия между этими SNP и клинико-патологическими факторами, такими как гистопатологический тип, размер опухоли, метастазы в лимфатических узлах и степень опухоли.

2. Участники исследования субъектов; будут разделены на две основные группы

   2.1. Случаи КРР группы I: 200 пациентов с КРР были набраны из университетских больниц Мансуры, ранее подписавших информированное согласие на участие в исследовании после получения необходимого одобрения наблюдательного совета институционального комитета по этике исследований (REC). Размер выборки рассчитывался в соответствии с теми же изученными SNP. в Британской Колумбии в китайском исследовании, согласно соответствующим статистическим методам. Критерий исключения; пациенты с ВГВ, шистосомозом, ВИЧ, употреблением алкоголя, дисфункцией щитовидной железы, воспалительными заболеваниями, сахарным диабетом и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Субъекты, получающие любую химиотерапию или лучевую терапию или перенесшие хирургическую операцию на ЖКТ, пациенты с заболеваниями крови, любым раком, кроме КРР, пациенты с заболеваниями нейронов, респираторными заболеваниями, заболеваниями матки, заболеваниями почек, циррозом печени, длительным применением кортикостероидов. или половые гормоны. Кроме того, пациенты с неполными данными или гистопатологическим диагнозом.

   Клинико-патологические критерии: Клинические данные будут получены из медицинских записей и оригинальных отчетов о патологии. Эти данные необходимо скомпилировать в файл Excel. Следующие клинические данные необходимо записать и оценить, как в прилагаемом файле Excel.

   • Для всех участников будет записан полный семейный анамнез. - Индивидуальный анамнез рака и клиническая оценка опухоли, выполненная с использованием классификации опухолевых узлов-метастазирования (TNM) Американского объединенного комитета по раку (AJCC),
   • Характеристики участников в отношении индекса массы тела (ИМТ), маркера(ов) воспаления, количества тромбоцитов, общего анализа крови и функциональных тестов печени, - гистопатологический тип рака, который необходимо определить, размер опухоли, а также клинико-патологические биомаркеры карциноэмбрионального рака. антиген (CEA) и антиген карциномы 19.9 (CA19.9), Данные Ki-67 или PCNA (если таковые имеются) будут собраны из файлов пациентов для дальнейшей корреляции и статистического анализа.
   • Для подгруппы пациентов с метастатическими заболеваниями (если таковые имеются или будет проводиться последующее наблюдение) тип лечения и место назначения метастазов, безрецидивная выживаемость (ББВ), общая выживаемость (ОВ), продолжительность выживаемости пациентов с момента время начала лечения будет рассматриваться как общепринятый прямой показатель клинической пользы.

   2.2. Контрольная группа: внешне здоровые, соответствующего возраста и пола, 200 добровольцев, не страдающие какими-либо заболеваниями и не принимающие никаких лекарств. Субъекты контрольной группы с нормальными функциями почек и уровнями ферментов печени, отсутствием каких-либо клинических или лабораторных признаков КРР были набраны во время плановых профилактических осмотров их самих или их родственников или из Национальной президентской программы скрининга хронических заболеваний.

3. Методология

3.1. Доступ к базам данных In silico:

• Комитет по номенклатуре генов HUGO (HGNC) при поддержке Национального института исследования генома человека (NHGRI) предоставил отчет https://www.gennames.org/ (по состоянию на апрель 2022 г.) и идентификация гена LINC00511 с использованием идентификации генной карты (по состоянию на апрель 2022 г.). Кроме того, экспрессия гена LINC00511 была получена в результате RNA-seq с использованием единицы данных TPM из 53 образцов тканей человека из проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) из Экспрессия генов в Атласе экспрессии у разных видов и биологических условий https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (по состоянию на 3 января 2022 г.).
• Выбор SNP: на основе предыдущего исследования Han et al. которые изучали несколько SNP LINC00511 при раке молочной железы и после скрининга на частоту минорных аллелей (MAF) выше 0,05 = ≥ 5%. MAF был получен из Международного ресурса образцов генома (IGSR). Поддержка открытых данных о вариациях человека https://www.internationalgenome.org/ в данных 1000 геномов https://www.ensembl.org/ 1000ГЕНОМОВ:фаза_3.

Веб-сервер SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- Доступ к bin/snpinfo/snpfunc.cgi осуществлялся для получения информации об SNP в последовательности ДНК и для прогнозирования влияния одного SNP на потенциальных соседей.

3.2. Образец крови объемом 5 мл, взятый у контрольной группы и пациентов с КРР, в вакутейнерах с антикоагулянтом ЭДТА и хранился при -80°C до биохимической оценки в Лаборатории перспективных биохимических исследований (ABRL), фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс (исследовательская база).

3.3. Экстракция ДНК из крови с использованием набора для экстракции QIAmp DNA Blood Mini из 200 мкл цельной крови в соответствии с инструкциями производителя. Количественный анализ ДНК проводился с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания).

3.4. Генотипирование SNP с помощью анализа генотипирования SNP TaqMan® будет использоваться для генотипирования SNP LINC00511 (rs17780195, rs9906859 и rs1558535) с использованием TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, США) и термоциклера StepOnePlus (Applied Biosystems, США). ).

3.5. Статистический анализ Статистический анализ проводился в программном обеспечении R (версия 4.2.0). Во-первых, частоты генотипов для каждого изученного SNP были проверены на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (HWE) с использованием критерия Хи-квадрат Пирсона χ 2 .

Критерий Стьюдента и критерий χ2 использовались для сравнения количественных и качественных переменных между группами CRC и контрольной группой соответственно. После поправки на демографические факторы (возраст, пол, ИМТ, семейный анамнез рака у родственников первой степени родства) была применена безусловная логистическая регрессия для изучения независимых факторов риска развития CRC среди исследованных SNP LINC00511 с использованием кодоминантного, доминантного, сверх- доминантные и рецессивные генотипические модели, которые затем сравниваются с использованием показателей соответствия модели и прогнозирования (информационный критерий Акаике (AIC), байесовский информационный критерий (BIC), информационный критерий отклонения (DIC), псевдоR2 (критерии Макфаддена, Кокса и Снелла и Нагелькерке)), а также кривая рабочих характеристик площади под приемником (AUC). Аддитивная/кодоминантная модель превосходила все модели, основанные на этих критериях. Чувствительность (SN), специфичность (SP), положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) были указаны для модели с наилучшим соответствием и прогностической силой (а не для простой диагностики заболевания). Оптимальные пороговые значения для возраста, CA19-9 и CEA-категоризации SNP LINC00511 были определены с помощью ROC-анализа. ИМТ был классифицирован на основе стандартных определений лиц с избыточным весом и ожирением (субъекты с ИМТ ≥ 25 кг/м2 считались избыточным весом или ожирением). Генотипы SNP были проанализированы с использованием библиотеки snpReady в R (Granato et al., 2018) [отсутствующие генотипы были вменены с использованием метода Райта (на основе равновесия Райта), а недостающие исходные демографические и клинические данные были вменены с использованием метода сопоставления прогнозируемых средних, реализованного в R (ван Бюрен и Гротуис-Оудсхорн, 2011)].

Был проведен множественный логистический регрессионный анализ для изучения связи между каждым аллелем SNP, генотипом, гаплотипом и распространенностью, стадией и степенью КРР с поправкой на исходные ковариаты (возраст, ИМТ и дополнительные факторы риска для стадии опухоли и степени опухоли, пациентов). семейный анамнез рака, локализация опухоли, история ВЗК), классические опухолевые маркеры (CEA и CA19.9), а также наличие или отсутствие сосудистой инфильтрации.

Логистическая регрессия Ферта реализовывалась в случае квазиразделения по одной или нескольким переменным. Программное обеспечение Haploview версии 2.0 использовалось для расчета r2 и D', поскольку измерения степени неравновесия по сцеплению между блоками парных комбинаций SNP разных генотипов определялись с использованием программного обеспечения SHEsis http://anaлиз.bio-x.cn/myAnalysis.php. Стратифицированный анализ и онлайн-программное обеспечение SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html применялся для дальнейшей оценки связи между SNP LINC00511 и восприимчивостью к CRC, а также частоты гаплотипов, поскольку измерение генетического распределения рассчитывалось непосредственно в CRC и здоровых контрольных группах. Кроме того, эпистаз был проанализирован с помощью программного обеспечения пакета многофакторного уменьшения размерности (MDR) в R https://ritchielab.org/software/mdr-download для проведения анализа взаимодействия SNP-SNP или ген-ген и SNP-среда или анализа взаимодействия ген-среда. применялся для оценки интерактивной роли генетических и демографических факторов (частота ложных открытий контролировалась путем корректировки уровня значимости с использованием Бенджамини и Хохберга, Бенджамини и Йекутиэли, понижения Холма, понижения Сидака и одноступенчатой ​​корректировки p-значения Сидака). процедуры). При сравнении прогностической способности моделей с использованием показателей псевдо-R-квадрата и SN, SP, PPV и NPV по кривой ROC, в дополнение к части MDR, это помогает прогнозировать rs LINC00511 SNP. Метод прогнозирования. Значения LD рассчитывали путем попарной оценки между SNP LINC00511, генотипированными в одной и той же выборке и в пределах заданного окна. Установленный метод использовался для оценки максимальной вероятности доли каждого возможного гаплотипа в двойной гетерозиготе.

Чтобы подтвердить, что различия между полученными результатами в группе пациентов не были случайными, к данным был применен расчет Бонферрони.

Наконец, исследователи проанализировали общую выживаемость (ОВ) в течение 2 лет у пациентов с КРР (n = 200), записывая дату смерти или последнего контакта с клиницистом в качестве конечной точки наблюдения. Для безрецидивной выживаемости (БВС), как и для безрецидивной выживаемости (БВС), у пациентов с неметастатическим КРР на момент постановки диагноза конечной точкой последующего наблюдения была дата рецидива или последнего контакта с клиницистом. Непараметрический метод Каплана-Мейера (PROC LIFETEST) применялся для кривых OS и EFS. Калькулятор вероятности выживания генерирует кривую Каплана-Мейера с 95% ДИ с использованием лог-рангового теста с использованием распределения Хи-квадрат для сравнения более чем двух групп.

Относительный риск рецидива заболевания оценивали как отношение рисков (ОР). Одновариантный анализ выживаемости проводился для пола, MBI, локализации опухоли, семейного анамнеза рака, поражения лимфатических узлов, стадии TNM и степени опухоли отдельно для группы пациентов с CRC, а также для генотипов SNP LINC00511.

Уровень значимости. Двустороннее значение P ≤ 0,05 считалось признаком статистической значимости.