Pitkän intergeenisen ei-koodaavan RNA:n 00511 (LINC00511) geneettisten variaatioiden merkitys paksusuolensyövässä

1. Johdanto

   1.1. Tausta Kolorektaalisyöpä (CRC) on Egyptin seitsemänneksi yleisin syöpä. CRC:n maailmanlaajuisen taakan odotetaan kasvavan 60 % vuoteen 2030 mennessä uusien tapausten ja kuolemantapausten osalta.

   Perinteisiin hoitoihin, mukaan lukien radio- ja kemoterapiat, liittyy erilaisia ​​ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Samaan aikaan CRC:n viiden vuoden eloonjäämisaste on ~ 64 %, mutta laskee 12 %:iin metastaattisen CRC:n tapauksessa. Siksi luotettavien ja tarkkojen prognostisten merkkien kehittäminen on välttämätöntä. Pitkillä ei-koodaavilla RNA:illa (lncRNA:illa) on tärkeä rooli eri syöpätyypeissä säätelemällä geeniekspressiota, proteiinisynteesiä, jotka ovat epigeneettisiä allekirjoituksia.

   Pitkä intergeeninen ncRNA 00511 (LINC00511) on 2265 bp:n ncRNA, jolla on onkogeeninen toiminto monissa syövissä, kuten glioomassa, munasarjasyövässä ja CRC:ssä. LncRNA:iden yhden nukleotidin polymorfismien (SNP:t) on havaittu liittyvän syöpään. Tällaiset geneettiset variantit voivat lisätä tai vähentää syöpäriskiä näiden SNP:iden sijainnista riippuen. Äskettäin LINC00511 SNP:t yhdistettiin rintasyövän (BC) riskiin Kiinan väestössä, ja tällä hetkellä pääohjaaja tutkii LINC00511 SNP:itä Egyptin BC:ssä. Lisäksi LINC00511 SNP:iden vaikutuksen käsitteleminen CRC:ssä, jota ei ole vielä tutkittu, saattaa olla hyödyllistä CRC:n patogeneesin ymmärtämisessä, LINC00511 SNP:iden yhdistämisessä taudin vakavuuteen sekä uuden kohteen löytämiseksi CRC:n ehkäisyyn ja/tai hoitoon.

   1.2. Työn tarkoitus LINC00511 SNP:n (rs17780195 tai rs9906859 ja rs1558535) ja CRC-herkkyyden ja/tai patogeneesin välisen yhteyden selvittäminen sekä näiden SNP:iden ja kliinisten patologisten tekijöiden, kuten kasvaimen koon, histopatologisen ei-tyypin, vuorovaikutuksen selvittäminen. kasvainaste.

2. Aiheet Opiskelijat; luokitellaan kahteen pääryhmään

   2.1. Ryhmän I CRC-tapaukset: 200 CRC-potilasta rekrytoitiin Mansouran yliopistollisista sairaaloista, jotka allekirjoittivat aiemmin tietoisen suostumuksen osallistua tutkimukseen saatuaan vaaditun institutionaalisen tutkimuksen eettisen komitean (REC) arviointilautakunnan hyväksynnän. Näytteen koko laskettiin samojen tutkittujen SNP:iden mukaan eKr. kiinalaisessa tutkimuksessa asiaankuuluvien tilastomenetelmien mukaan. poissulkemiskriteerit; potilailla, joilla on HBV, skitosomiaasi, HIV, alkoholin nauttiminen, kilpirauhasen vajaatoiminta, tulehdussairaudet, diabetes mellitus ja sydän- ja verisuonitaudit. Potilaat, jotka ovat saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa tai joille on tehty GIT-leikkaus, potilaat, joilla on verisairaus, mikä tahansa muu syöpä kuin CRC, potilaat, joilla on hermosairaudet, hengityselinten sairaudet, kohdun sairaudet, munuaissairaudet, maksakirroosi, pitkäaikainen kortikosteroidien käyttö tai sukupuolihormonit. Lisäksi potilaat, joilla on puutteelliset tiedot tai histopatologinen diagnoosi.

   Kliinis-patologiset kriteerit: Kliiniset tiedot saadaan lääketieteellisistä tiedoista ja alkuperäisistä patologiaraporteista. Nämä tiedot kootaan Excel-tiedostoon. Seuraavat kliiniset tiedot tallennetaan ja arvioidaan liitteenä olevan Excel-tiedoston mukaisesti.

   • Kaikkien osallistujien täydellinen sukuhistoria kirjataan, - Yksilöllinen syöpähistoria ja kasvaimen kliininen arviointi, joka tehdään käyttämällä American Joint Committee on Cancer (AJCC) -luokitusta (TNM).
   • Osallistujien ominaisuudet painoindeksin (BMI), tulehdusmarkkerin (-merkkien), verihiutaleiden määrän, CBC:n ja maksan toimintakokeiden osalta, - määritettävä syövän histopatologinen tyyppi, kasvaimen koko sekä kliinis-patologiset karsinoembryonaaliset biomarkkerit antigeeni (CEA) ja karsinoomaantigeeni 19.9 (CA19.9), Ki-67- tai PCNA-tiedot (jos sellaisia ​​on) kerätään potilastiedostoista lisäkorrelaatioita ja tilastollista analyysiä varten,
   • Metastaattisten potilaiden alaryhmälle (jos sellainen on tai jos seurantaa tehdään) hoitotyyppi ja etäpesäkkeiden määränpääpaikka, taudista vapaa eloonjääminen (DFS), kokonaiseloonjääminen (OS), potilaan eloonjäämisen kesto hoidon aloitusajankohtaa pidetään yleisesti hyväksyttynä suorana kliinisen hyödyn mittana.

   2.2. Kontrolliryhmä: näennäisesti terve, ikä ja sukupuoli vastaavat, 200 vapaaehtoista, jotka eivät kärsi mistään sairaudesta tai käytä lääkkeitä. Kontrollihenkilöt, joilla oli normaali munuaisten toiminta ja maksaentsyymitasot ja joilla ei ollut kliinisiä tai laboratoriotutkimuksia CRC:stä, otettiin mukaan rutiinitarkastusten aikana itselleen tai heidän sukulaisilleen tai Kroonisten sairauksien seulontaohjelmasta.

3. Metodologia

3.1. Pääsy tietokantoihin in silico:

• National Human Genome Research Instituten (NHGRI) tukema HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) antoi raportin https://www.gennames.org/ (saatu huhtikuussa 2022) ja LINC00511-geenin tunnistaminen geenikorttitunnistuksen avulla (saatu huhtikuussa 2022). Lisäksi LINC00511-geenin ilmentyminen saatiin RNA-seq:stä käyttämällä tietoyksikköä TPM, 53 ihmisen kudosnäytteestä Genotype-Tissue Expression (GTEx) -projektista Expression Atlas -geenin ilmentymisestä lajien ja biologisten olosuhteiden välillä https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (käytetty 3. tammikuuta 2022).
• SNP-valinta: Perustuu Han et al. jotka tutkivat useita LINC00511 SNP:itä rintasyövässä ja yli 0,05 = ≥ 5 %:n vähäisen alleelitaajuuden (MAF) seulonnan jälkeen. MAF saatiin kansainvälisestä genominäyteresurssista (IGSR), joka tukee avointa ihmisen variaatiodataa https://www.internationalgenome.org/ 1000 genomitiedoissa https://www.ensembl.org/ 1000 GENOMIA:vaihe_3.

SNPinfo-verkkopalvelin http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi käytettiin SNP-tietojen saamiseksi DNA-sekvenssissä ja yhden SNP-vaikutuksen ennustamiseksi mahdollisiin naapureihin.

3.2. Verinäyte 5 ml otettiin kontrolleista ja CRC-potilaista EDTA-antikoagulanttivacutainers -laitteilla ja säilytettiin -80 ºC:ssa, kunnes biokemiallinen arviointi Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Farmasian tiedekunnassa, Ain Shams University (tutkimusympäristö).

3.3. DNA:n erottaminen verestä käyttämällä QIAmp DNA Blood Mini -uuttosarjaa 200 µl:sta kokoverta valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA:n kvantifiointi suoritettiin NanoDrop 2000:lla (Thermo Fisher Scientific, UK).

3.4. SNP:iden genotyypitystä TaqMan® SNP-genotyypitysmäärityksellä käytetään LINC00511 SNP:n (rs17780195, rs9906859 ja rs1558535) genotyypitykseen käyttämällä TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USApplied Scientific, USA) ).

3.5. Tilastollinen analyysi Tilastollinen analyysi suoritettiin R-ohjelmistolla (versio 4.2.0). Ensin jokaisen tutkitun SNP:n genotyyppitaajuudet tarkistettiin olevan Hardy-Weinbergin tasapainon (HWE) mukaisia ​​käyttämällä Pearsonin χ 2 Chi-neliötestejä.

Studentin t-testiä ja χ2-testiä käytettiin kvantitatiivisten ja kvalitatiivisten muuttujien vertaamiseen CRC- ja vertailuryhmien välillä. Demografisiin tekijöihin (ikä, sukupuoli, BMI, ensimmäisen asteen sukulaisten syöpäsairaushistoria) sopeutumisen jälkeen sovellettiin ehdotonta logistista regressiota CRC:n riippumattomien riskitekijöiden tutkimiseksi tutkittujen LINC00511 SNP:iden joukossa käyttämällä yhteisdominoivaa, hallitsevaa, yli- hallitsevia ja resessiivisiä genotyyppimalleja, joita sitten verrataan käyttämällä mallinsovituksen ja ennusteen mittareita (Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFaddenin, Coxin ja Snellin mallit ja Nagelkerken)) ja vastaanottimen alialueen toimintaominaisuuksien (AUC) käyrä. Lisäaine/kodominanttimalli oli näiden kriteerien perusteella parempi kuin kaikki mallit. Sensitiivisyys (SN), spesifisyys (SP), positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) raportoitiin mallille, jolla oli paras istuvuus ja ennustekyky (ei pelkkään sairauden diagnoosiin). LINC00511 SNP:iden iän, CA19-9- ja CEA-luokituksen optimaaliset raja-arvot määritettiin käyttämällä ROC-analyysiä. BMI luokiteltiin ylipainoisten ja liikalihavien yksilöiden standardimääritelmien perusteella (henkilöitä, joiden BMI oli ≥ 25 kg/m2, pidettiin ylipainoisina tai liikalihavina). SNP:iden genotyypit analysoitiin käyttämällä snpReady-kirjastoa R:ssä (Granato et al., 2018) [puuttuvat genotyypit imputoitiin Wrightin menetelmällä (perustuu Wrightin tasapainoon) ja puuttuvat demografiset ja kliiniset perustiedot imputoitiin käyttämällä R:ssä toteutettua ennustavaa keskiarvosovitusmenetelmää. (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Useat logistiset regressioanalyysit tehtiin kunkin SNP-alleelin, genotyyppien, haplotyyppien ja CRC:n esiintyvyyden, vaiheen ja asteen välisen yhteyden tutkimiseksi samalla kun mukautettiin lähtötason kovariaatteja (ikä, BMI ja muut riskitekijät kasvaimen vaiheeseen ja kasvainluokkaan, potilaat syövän sukuhistoria, kasvainkohta, IBD:n historia, klassiset kasvainmarkkerit (CEA ja CA19.9) ja verisuonten infiltraation olemassaolo tai puuttuminen.

Firthin logistinen regressio toteutettiin yhden tai useamman muuttujan kvasierottelun tapauksessa. Haploview-ohjelmiston versiota 2.0 käytettiin r2:n ja D':n laskemiseen, koska eri genotyyppien parikohtaisten SNP-yhdistelmien välisen kytkentäepätasapainon mittaukset määritettiin käyttämällä SHEsis-ohjelmistoa http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Kerrostettu analyysi ja SHEsis plus -verkkoohjelmisto http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html Käytettiin edelleen arvioimaan LINC00511 SNP:iden ja CRC-herkkyyden sekä haplotyyppien esiintymistiheyttä, koska geneettisen jakautumisen mittaus laskettiin suoraan CRC- ja terveissä kontrolliryhmissä. Lisäksi epistasia analysoitiin Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) -pakettiohjelmistolla R https://ritchielab.org/software/mdr-download SNP-SNP- tai geenigeeni- ja SNP-ympäristö- tai geeni-ympäristövuorovaikutusanalyysin suorittamiseksi. sovellettiin geneettisten ja demografisten tekijöiden vuorovaikutteisen roolin arvioimiseen (väärä löytöprosenttia ohjattiin säätämällä merkitsevyystasoa käyttämällä Benjamini ja Hochberg, Benjamini ja Yekutieli, Holm alentaa, Sidak step down ja Sidak yksivaiheinen p-arvon säätö menettelyt). Verrattaessa mallien ennustekykyä pseudo-R-neliömitoilla ja SN-, SP-, PPV- ja NPV-käyrällä ROC-käyrällä, MDR-osan lisäksi on apua LINC00511 SNP:n rs-ennusteelle. Ennustemenetelmä LD-arvot laskettiin pareittain arvioimalla LINC00511 SNP:t, jotka genotyypisivät samassa näytteessä ja tietyssä ikkunassa. Vakiintunutta menetelmää käytettiin arvioimaan suurin todennäköisyys sille osuudelle, että kukin mahdollinen haplotyyppi vaikutti kaksoisheterotsygoottiin.

Sen varmistamiseksi, että potilasryhmässä saatujen tulosten väliset erot eivät olleet sattumaa, dataan sovellettiin Bonferroni-laskelmaa.

Lopuksi tutkijat analysoivat CRC-potilaiden (n = 200) kahden vuoden kokonaiseloonjäämisen (n = 200) ja kirjasivat kuolinpäivämäärän tai viimeisen kontaktin lääkäriin seurannan päätepisteenä. Taudista vapaan eloonjäämisen (DFS), tapahtumavapaan eloonjäämisen (EFS) osalta potilailla, joilla oli ei-metastaattinen CRC diagnoosihetkellä, relapsin päivämäärä tai viimeinen kontakti lääkäriin oli seurannan päätepiste. Ei-parametrinen Kaplan-Meier-menetelmä (PROC LIFETEST) tehtiin käyttöjärjestelmäkäyrille ja EFS:lle. Eloonjäämistodennäköisyyslaskin muodostaa Kaplan-Meier-käyrän 95 %:n luottamusvälillä käyttämällä log-rank-testiä käyttäen Chi-neliöjakaumaa useamman kuin kahden ryhmän vertailuun.

Sairauden uusiutumisen suhteellinen riski arvioitiin riskisuhteena (HR). Yksimuuttujat eloonjäämisanalyysit tehtiin sukupuolen, MBI:n, kasvainkohdan, suvussa esiintyneen syövän, imusolmukkeiden osallistumisen, TNM-vaiheen ja kasvaimen asteiden osalta erikseen, CRC-potilasryhmälle sekä LINC00511 SNP:iden genotyypeille.

Merkityksen taso. Kaksipuolista arvoa P ≤ 0,05 pidettiin merkkinä tilastollisesta merkitsevyydestä.