Důsledky genetických variací v dlouhé intergenové nekódující RNA 00511 (LINC00511) u kolorektálního karcinomu

1. Úvod

   1.1. Pozadí Kolorektální karcinom (CRC) představuje 7. nejčastější rakovinu v Egyptě. Očekává se, že globální zátěž CRC vzroste do roku 2030 o 60 %, pokud jde o nové případy a úmrtí.

   Tradiční léčba včetně radioterapie a chemoterapie je spojena s různými nežádoucími vedlejšími účinky. Mezitím je míra 5letého přežití u CRC ~ 64 %, ale u metastatického CRC klesá na 12 %. Proto je nezbytný vývoj spolehlivých a přesných prognostických markerů. Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) hrají důležitou roli u různých typů rakoviny prostřednictvím regulace genové exprese, syntézy proteinů, což jsou epigenetické signatury.

   Long intergenic ncRNA 00511 (LINC00511) je 2265 bp ncRNA, která má onkogenní funkci u mnoha rakovin, jako je gliom, rakovina vaječníků a CRC. Bylo zjištěno, že jednonukleotidové polymorfismy (SNP) v lncRNA jsou spojeny s rakovinou. Takové genetické varianty mohou zvýšit nebo snížit riziko rakoviny v závislosti na umístění těchto SNP. Nedávno byly LINC00511 SNP spojeny s rizikem rakoviny prsu (BC) v čínské populaci a v současné době hlavní supervizor studuje LINC00511 SNP v egyptské BC. Kromě toho řešení implikace LINC00511 SNP v CRC, které dosud nebylo studováno, by mohlo být užitečné pro pochopení patogeneze CRC, spojení LINC00511 SNP se závažností onemocnění, stejně jako pro objevování nového cíle pro prevenci a/nebo léčbu CRC.

   1.2. Cíl práce Zkoumání souvislosti mezi LINC00511 SNP (rs17780195 nebo rs9906859 a rs1558535) a citlivostí a/nebo patogenezí CRC kromě zjištění interakce mezi těmito SNP a klinickopatologickými faktory, jako je histopatologický typ lymfatických uzlin a velikost metastáz, velikost nádoru stupeň nádoru.

2. Předměty Účastníci studie; budou rozděleny do dvou hlavních skupin

   2.1. Případy CRC skupiny I: 200 pacientů s CRC bylo přijato z univerzitních nemocnic v Mansourě, kteří předtím podepsali informovaný souhlas s účastí ve studii poté, co získali požadovaný souhlas revizní komise institucionální výzkumné etické komise (REC), velikost vzorku byla vypočtena podle stejných studovaných SNP v BC v čínské studii, podle příslušných statistických metod. Kritéria vyloučení; pacienti s HBV, schistosomiázou, HIV, konzumací alkoholu, dysfunkcí štítné žlázy, zánětlivými onemocněními, diabetes mellitus a kardiovaskulárními poruchami. Subjekty, které dostávají jakoukoli chemoterapii nebo radioterapii nebo podstoupily chirurgický zákrok GIT, pacienti s onemocněním krve, jakýmkoli jiným nádorovým onemocněním než CRC, pacienti s neuronálními onemocněními, onemocněními dýchacích cest, onemocněními dělohy, onemocněními ledvin, cirhózou jater, dlouhodobým užíváním kortikosteroidů nebo pohlavní hormony. Dále pacienti s neúplnými daty nebo histopatologickou diagnózou.

   Klinicko-patologická kritéria: Klinická data budou získána z lékařských záznamů a původních patologických zpráv. Tato data se zkompilují do souboru Excel. Následující klinická data se zaznamenávají a vyhodnocují jako v přiloženém excelovém souboru.

   • U všech účastníků bude zaznamenána úplná rodinná anamnéza, -Individuální anamnéza rakoviny a klinické hodnocení nádoru provedené pomocí klasifikace metastáz v nádorových uzlinách (TNM) podle American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • Charakteristiky účastníků s ohledem na index tělesné hmotnosti (BMI), marker(y) zánětu, počet krevních destiček, CBC a jaterní testy, - histopatologický typ rakoviny, který má být stanoven, velikost nádoru, stejně jako klinicko-patologické biomarkery karcinoembryonální antigen (CEA) a antigen karcinomu 19.9 (CA19.9), Údaje Ki-67 nebo PCNA (pokud existují) budou shromažďovány ze souborů pacientů pro další korelace a statistickou analýzu,
   • Pro podskupinu metastatických pacientů (pokud existuje nebo bude provedeno sledování) typ léčby a místo metastatického cíle, přežití bez onemocnění (DFS), celkové přežití (OS), délka přežití pacienta od čas zahájení léčby, bude považován za všeobecně uznávané přímé měřítko klinického přínosu.

   2.2. Kontrolní skupina: zjevně zdraví, věk a pohlaví odpovídající, 200 dobrovolníků, kteří netrpí žádnou nemocí ani neužívají žádné léky. Kontrolní jedinci s normální funkcí ledvin a hladinami jaterních enzymů, bez jakýchkoli klinických nebo laboratorních důkazů CRC, byli vybráni během rutinních kontrolních vyšetření pro sebe nebo své příbuzné nebo z Národního prezidentského programu screeningu chronických onemocnění.

3. Metodologie

3.1. Přístup k databázím In silico:

• Výbor HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) podporovaný National Human Genome Research Institute (NHGRI) poskytl zprávu https://www.genenames.org/ (přístup v dubnu 2022) a identifikace genu LINC00511 pomocí identifikace genové karty (přístup v dubnu 2022). Kromě toho byla exprese genu LINC00511 získána z RNA-seq pomocí datové jednotky TPM, z 53 vzorků lidské tkáně z projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) z Expression Atlas Gene expression napříč druhy a biologickými podmínkami https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (přístup 3. ledna 2022).
• Výběr SNP: Na základě předchozí studie Han et al. kteří studovali několik LINC00511 SNP u rakoviny prsu a po screeningu na frekvenci minoritních alel (MAF) nad 0,05= ≥ 5 %. MAF byl získán z International Genome Sample Resource (IGSR) Podporující otevřená data o lidských variacích https://www.internationalgenome.org/ v datech 1000 genomů https://www.ensembl.org/ 1000 GENOMŮ: fáze_3.

Webový server SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi byl zpřístupněn pro získání informací o SNP v sekvenci DNA a pro predikci jednoho účinku SNP na potenciální sousedy.

3.2. Vzorky krve 5 ml odebrané kontrolám a pacientům s CRC, na EDTA antikoagulačních vakuových nádobách a skladované při -80º C, až do biochemického hodnocení v Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Farmaceutická fakulta, Univerzita Ain Shams (výzkumné prostředí).

3.3. Extrakce DNA z krve pomocí extrakční soupravy QIAmp DNA Blood Mini z 200 μl plné krve podle pokynů výrobce. Kvantifikace DNA byla provedena pomocí NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, UK).

3.4. Genotypování SNP pomocí genotypizačního testu TaqMan® SNP bude použito k provedení genotypizace pro LINC00511 SNP (rs17780195, rs9906859 a rs1558535) pomocí TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo App Fisher Scientific, USA, Thermo, Bios. ).

3.5. Statistická analýza Statistická analýza byla provedena v softwaru R (verze 4.2.0). Nejprve byly zkontrolovány genotypové frekvence pro každý studovaný SNP, aby byly v souladu s Hardy-Weinbergovou rovnováhou (HWE) pomocí Pearsonových χ 2 Chi-kvadrát testů.

Studentův t-test a χ2 test byly použity k porovnání kvantitativních a kvalitativních proměnných mezi CRC a kontrolními skupinami. Po úpravě o demografické faktory (věk, pohlaví, BMI, rodinná anamnéza rakoviny u příbuzných prvního stupně) byla použita bezpodmínečná logistická regrese k prozkoumání nezávislých rizikových faktorů pro CRC mezi zkoumanými LINC00511 SNP pomocí kodominantních, dominantních, nadměrných dominantní a recesivní genotypové modely, které jsou poté porovnávány pomocí měření shody modelu a predikce (Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFadden's, Cox and Snell's, and Nagelkerke's)) a křivka provozních charakteristik oblasti pod přijímačem (AUC). Aditivní/kodominantní model byl lepší než všechny modely založené na těchto kritériích. Senzitivita (SN), specificita (SP), pozitivní prediktivní hodnota (PPV) a negativní predikovaná hodnota (NPV) byly hlášeny pro model s nejlepší shodou a prediktivní schopností (nikoli pro pouhou diagnózu onemocnění). Optimální hraniční hodnoty pro věk, CA19-9 a kategorizaci CEA LINC00511 SNP byly stanoveny pomocí ROC analýzy. BMI byl kategorizován na základě standardních definic jedinců s nadváhou a obezitou (subjekty s BMI ≥ 25 kg/m2 byly považovány za osoby s nadváhou nebo obezitou). Genotypy SNP byly analyzovány pomocí knihovny snpReady v R (Granato et al., 2018) [chybějící genotypy byly imputovány pomocí Wrightovy metody (založené na Wrightově rovnováze) a chybějící výchozí demografická a klinická data byla imputována pomocí metody prediktivního středního párování implementované v R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Byla provedena vícenásobná logistická regresní analýza, aby se prozkoumala souvislost mezi jednotlivými alelami SNP, genotypy, haplotypy a prevalencí CRC, stádiem a stupněm, při úpravě na základní kovariáty (věk, BMI a další rizikové faktory pro stádium nádoru a stupeň nádoru, pacienti rodinná anamnéza rakoviny, místo nádoru, anamnéza IBD), klasické nádorové markery (CEA a CA19.9) a přítomnost nebo nepřítomnost vaskulární infiltrace.

Firthova logistická regrese byla implementována v případě kvazi-separace v jedné nebo více proměnných. Pro výpočet r2 a D' byl použit software Haploview verze 2.0, protože měření rozsahu vazebné nerovnováhy mezi bloky párových kombinací SNP různých genotypů byla stanovena pomocí softwaru SHEsis http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Stratifikovaná analýza a online software SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html aplikovaný k dalšímu hodnocení asociace mezi LINC00511 SNP a citlivostí CRC, stejně jako četnost haplotypů, protože měření genetické distribuce bylo přímo vypočteno v CRC a zdravých kontrolních skupinách. Dále byla epistáza analyzována pomocí softwaru balíčku Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) v R https://ritchielab.org/software/mdr-download pro provádění analýzy interakce SNP-SNP nebo gen-gen a SNP-Environment nebo gen-prostředí, použito k vyhodnocení interaktivní role genetických a demografických faktorů (falešná míra objevení byla řízena úpravou hladiny významnosti pomocí Benjaminiho a Hochberga, Benjaminiho a Yekutieliho, Holmovo snížení, Sidak snížení a Sidak jednokrokové úpravy p-hodnoty postupy). Při porovnávání prediktivní schopnosti modelů využívajících pseudo-R-kvadrát míry a křivky SN, SP, PPV a NPV by ROC, kromě části MDR, pomáhá predikce SNPs rs LINC00511. Metoda predikce Hodnoty LD byly vypočteny párovým odhadem mezi LINC00511 SNP genotypizovanými ve stejném vzorku a v daném okně. K odhadu maximální pravděpodobnosti podílu, kterým každý možný haplotyp přispěl k dvojitému heterozygotovi, byla použita zavedená metoda.

Aby rozdíly mezi získanými výsledky ve skupině pacientů nebyly náhodné, byl na data aplikován Bonferroniho výpočet.

Nakonec výzkumníci analyzovali celkové přežití (OS) po dobu 2 let u pacientů s CRC (n=200) se záznamem data úmrtí nebo posledního kontaktu s klinikem jako koncovým bodem sledování. Pro přežití bez onemocnění (DFS), jako přežití bez příhody (EFS), u pacientů s nemetastazujícím CRC v době diagnózy bylo konečným bodem sledování datum relapsu nebo posledního kontaktu s klinikem. Pro křivky OS a EFS byla provedena neparametrická Kaplan-Meierova metoda (PROC LIFETEST). Kalkulátor pravděpodobnosti přežití generuje Kaplan-Meierovu křivku s 95% CI pomocí log-rank testu s použitím Chi kvadrát distribuce pro srovnání více než dvou skupin.

Relativní riziko relapsu onemocnění bylo odhadnuto jako poměr rizik (HR). Univariabilní analýzy přežití byly provedeny pro pohlaví, MBI, místo nádoru, rodinnou anamnézu rakoviny, postižení lymfatických uzlin, stádium TNM a stupně nádoru samostatně, pro skupinu pacientů s CRC a také pro genotypy LINC00511 SNP.

Úroveň významnosti. Dvoustranná hodnota P ≤ 0,05 byla považována za znak statistické významnosti.