Implication des variations génétiques de l'ARN long intergénique non codant 00511 (LINC00511) dans le cancer colorectal

1. Introduction

   1.1. Contexte Le cancer colorectal (CCR) représente le 7ème cancer le plus répandu en Égypte. Le fardeau mondial du CCR devrait augmenter de 60 % d’ici 2030, en termes de nouveaux cas et de décès.

   Les traitements traditionnels, notamment les radiothérapies et les chimiothérapies, sont associés à divers effets secondaires indésirables. Pendant ce temps, le taux de survie à 5 ans pour le CCR est d'environ 64 % mais tombe à 12 % pour le CCR métastatique. Il est donc nécessaire de développer des marqueurs pronostiques fiables et précis. Les ARN longs non codants (lncRNA) jouent un rôle important dans différents types de cancer en régulant l'expression des gènes, la synthèse des protéines, qui sont des signatures épigénétiques.

   L'ARNnc intergénique long 00511 (LINC00511) est un ARNnc de 2 265 pb qui exerce une fonction oncogène dans de nombreux cancers, tels que le gliome, le cancer de l'ovaire et le CCR. Il a été démontré que les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) dans les ARNnc sont associés au cancer. De telles variantes génétiques peuvent augmenter ou réduire le risque de cancer en fonction de la localisation de ces SNP. Récemment, les SNP LINC00511 ont été associés au risque de cancer du sein (BC) dans la population chinoise et actuellement, le superviseur en chef étudie les SNP LINC00511 en Colombie-Britannique égyptienne. De plus, étudier l'implication des SNP LINC00511 dans le CCR, qui n'a pas encore été étudiée, pourrait être utile pour comprendre la pathogenèse du CCR, relier les SNP LINC00511 à la gravité de la maladie, ainsi que pour découvrir de nouvelles cibles pour la prévention et/ou le traitement du CCR.

   1.2. Objectif du travail Étude de l'association entre les SNP LINC00511 (rs17780195 ou rs9906859 et rs1558535) et la susceptibilité et/ou la pathogenèse du CCR, en plus de découvrir l'interaction entre ces SNP et des facteurs clinicopathologiques tels que le type histopathologique, la taille de la tumeur, les métastases ganglionnaires et grade tumoral.

2. Sujets participants à l'étude ; sera classé en deux groupes principaux

   2.1. Cas de CCR du groupe I : 200 patients atteints de CCR ont été recrutés dans les hôpitaux universitaires de Mansoura et ont préalablement signé un consentement éclairé pour participer à l'étude après avoir obtenu l'approbation du comité d'examen du comité d'éthique de la recherche institutionnel (REC). La taille de l'échantillon a été calculée en fonction des mêmes SNP étudiés. en Colombie-Britannique dans une étude chinoise, selon les méthodes statistiques pertinentes. Critère d'exclusion; patients atteints du VHB, de la schistosomiase, du VIH, de la consommation d'alcool, de dysfonctionnements thyroïdiens, de maladies inflammatoires, de diabète sucré et de troubles cardiovasculaires. Sujets recevant une chimiothérapie ou une radiothérapie, ou ayant subi une opération chirurgicale du GIT, patients atteints de troubles sanguins, de tout cancer autre que le CCR, patients atteints de maladies neuronales, de maladies respiratoires, de maladies utérines, de maladies rénales, de cirrhose du foie, d'utilisation prolongée de corticostéroïdes ou des hormones sexuelles. De plus, les patients dont les données ou le diagnostic histopathologique sont incomplets.

   Critères clinico-pathologiques : Les données cliniques seront obtenues à partir des dossiers médicaux et des rapports de pathologie originaux. Ces données doivent être compilées dans un fichier Excel. Les données cliniques suivantes doivent être enregistrées et évaluées comme dans le fichier Excel ci-joint.

   • Les antécédents familiaux complets seront enregistrés pour tous les participants, -Les antécédents individuels de cancer et l'évaluation clinique de la tumeur effectuée à l'aide de la classification tumeur-ganglion-métastase (TNM) de l'American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • Les caractéristiques des participants en matière d'indice de masse corporelle (IMC), de marqueur(s) d'inflammation, de numération plaquettaire, de CBC et de tests de la fonction hépatique, -Type histopathologique du cancer à déterminer, taille de la tumeur, ainsi que biomarqueurs clinico-pathologiques carcinoembryonnaires antigène (CEA) et antigène du carcinome 19.9 (CA19.9), Les données Ki-67 ou PCNA (le cas échéant) seront collectées à partir des dossiers des patients pour des corrélations et une analyse statistique plus approfondies,
   • Pour le sous-groupe de patients métastatiques (le cas échéant, ou si un suivi sera effectué), le type de traitement et le site de destination métastatique, la survie sans maladie (DFS), la survie globale (OS), la durée de survie du patient à partir du Le moment du début du traitement sera considéré comme une mesure directe universellement acceptée du bénéfice clinique.

   2.2. Groupe témoin : apparemment en bonne santé, d'âge et de sexe appariés, 200 volontaires, ne souffrant d'aucune maladie et ne prenant aucun médicament. Des sujets témoins présentant des fonctions rénales et des taux d'enzymes hépatiques normaux, sans aucune preuve clinique ou de laboratoire de CCR, ont été recrutés lors d'examens de contrôle de routine pour eux-mêmes ou leurs proches ou dans le cadre du programme présidentiel national de dépistage des maladies chroniques.

3. Méthodologie

3.1. Accès aux bases de données in silico :

• Le Comité de nomenclature des gènes HUGO (HGNC), soutenu par l'Institut national de recherche sur le génome humain (NHGRI), a fourni un rapport https://www.genenames.org/ (consulté en avril 2022) et identification du gène LINC00511 à l’aide de l’identification par carte génétique (consulté en avril 2022). De plus, l'expression du gène LINC00511 a été obtenue à partir de RNA-seq à l'aide de l'unité de données TPM, à partir de 53 échantillons de tissus humains du projet Genotype-Tissue Expression (GTEx) d'Expression Atlas Gene expression à travers les espèces et les conditions biologiques https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (consulté le 3 janvier 2022).
• Sélection de SNP : sur la base de l'étude précédente de Han et al. qui a étudié plusieurs SNP LINC00511 dans le cancer du sein et après dépistage d'une fréquence d'allèles mineurs (MAF) supérieure à 0,05 = ≥ 5 %. Le MAF a été obtenu auprès de l'International Genome Sample Resource (IGSR) prenant en charge les données ouvertes sur la variation humaine https://www.internationalgenome.org/ dans 1000 données génomiques https://www.ensembl.org/ 1000GÉNOMES : phase_3.

Serveur Web SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi a été consulté pour obtenir des informations sur le SNP dans la séquence d'ADN et pour prédire un effet du SNP sur les voisins potentiels.

3.2. Prélèvement sanguin de 5 ml prélevés sur des témoins et des patients CCR, sur des vacutainers anticoagulants EDTA et conservés à -80 ° C, jusqu'à l'évaluation biochimique au Laboratoire de recherche avancée en biochimie (ABRL), Faculté de pharmacie, Université Ain Shams (milieu de recherche).

3.3. Extraction de l'ADN du sang à l'aide d'un kit d'extraction QIAmp DNA Blood Mini à partir de 200 μL de sang total, conformément aux instructions du fabricant. La quantification de l'ADN a été réalisée par NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni).

3.4. Le génotypage des SNP à l'aide du test de génotypage TaqMan® SNP sera utilisé pour effectuer le génotypage des SNP LINC00511 (rs17780195, rs9906859 et rs1558535) en utilisant le TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) et le thermocycleur StepOnePlus (Applied Biosystems, USA). ).

3.5. Analyse statistique L'analyse statistique a été réalisée dans le logiciel R (version 4.2.0). Tout d'abord, les fréquences des génotypes de chaque SNP étudié ont été vérifiées pour être conformes à l'équilibre de Hardy-Weinberg (HWE) à l'aide des tests du chi carré χ 2 de Pearson.

Le test t de Student et le test χ2 ont été utilisés pour comparer les variables quantitatives et qualitatives entre les groupes CRC et témoin, respectivement. Après ajustement en fonction des facteurs démographiques (âge, sexe, IMC, antécédents familiaux de cancer chez les parents au premier degré), une régression logistique inconditionnelle a été appliquée pour explorer les facteurs de risque indépendants de CCR parmi les SNP LINC00511 examinés en utilisant les catégories codominante, dominante, sur- modèles génotypiques dominants et récessifs, puis comparés à l'aide de mesures d'ajustement et de prédiction du modèle (le critère d'information d'Akaike (AIC), le critère d'information bayésien (BIC), le critère d'information de déviance (DIC), le pseudo R2 (McFadden, Cox et Snell, et Nagelkerke)) et la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (AUC). Le modèle additif/codominant était supérieur à tous les modèles basés sur ces critères. La sensibilité (SN), la spécificité (SP), la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédite négative (VPN) ont été rapportées pour le modèle présentant le meilleur ajustement et le meilleur pouvoir prédictif (et non pour un simple diagnostic de maladie). Les seuils optimaux pour l'âge, la catégorisation CA19-9 et CEA des SNP LINC00511 ont été déterminés à l'aide de l'analyse ROC. L'IMC a été catégorisé sur la base des définitions standard des individus en surpoids et obèses (les sujets avec un IMC ≥ 25 kg/m2 étaient considérés comme en surpoids ou obèses). Les génotypes des SNP ont été analysés à l'aide de la bibliothèque snpReady dans R (Granato et al., 2018) [les génotypes manquants ont été imputés à l'aide de la méthode de Wright (basée sur l'équilibre de Wright) et les données démographiques et cliniques de base manquantes ont été imputées à l'aide de la méthode d'appariement moyenne prédictive mise en œuvre dans R. (van Buuren et Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Une analyse de régression logistique multiple a été réalisée pour examiner l'association entre chaque allèle, génotype, haplotype et prévalence, stade et grade du CCR, tout en ajustant les covariables de base (âge, IMC et facteurs de risque supplémentaires pour le stade et le grade de la tumeur, les patients). ' antécédents familiaux de cancer, site tumoral, antécédents de MII), marqueurs tumoraux classiques (CEA et CA19.9) et présence ou absence d'infiltration vasculaire.

La régression logistique de Firth a été mise en œuvre dans le cas de quasi-séparation dans une ou plusieurs variables. La version 2.0 du logiciel Haploview a été utilisée pour calculer r2 et D', car les mesures de l'étendue du déséquilibre de liaison entre des blocs de combinaisons de SNP par paires de différents génotypes ont été déterminées à l'aide du logiciel SHEsis http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Une analyse stratifiée et le logiciel en ligne SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html appliqué pour évaluer plus en détail l'association entre les SNP LINC00511 et la susceptibilité au CRC ainsi que la fréquence des haplotypes, car une mesure de la distribution génétique a été directement calculée dans les groupes CRC et témoins sains. En outre, l'épistase a été analysée par le logiciel de réduction de dimensionnalité multifactorielle (MDR) dans R https://ritchielab.org/software/mdr-download pour effectuer une analyse d'interaction SNP-SNP ou gène-gène et SNP-environnement ou gène-environnement, appliqué pour évaluer le rôle interactif des facteurs génétiques et démographiques (le taux de fausse découverte a été contrôlé en ajustant le niveau de signification à l'aide de Benjamini et Hochberg, Benjamini et Yekutieli, de la réduction de Holm, de la réduction de Sidak et de l'ajustement de la valeur p en une seule étape de Sidak procédures). Lors de la comparaison de la capacité prédictive des modèles utilisant les mesures pseudo-R-carré et les courbes SN, SP, PPV et NPV par ROC, en plus de la partie MDR, cela facilite la prédiction des SNP rs LINC00511. Les valeurs LD de la méthode de prédiction ont été calculées par une estimation par paire entre les SNP LINC00511 génotypés dans le même échantillon et dans une fenêtre donnée. Une méthode établie a été utilisée pour estimer la probabilité maximale de la proportion selon laquelle chaque haplotype possible contribuait au double hétérozygote.

Pour confirmer que les différences entre les résultats obtenus dans le groupe de patients n'étaient pas fortuites, un calcul de Bonferroni a été appliqué aux données.

Enfin, les enquêteurs ont analysé la survie globale (SG) pendant 2 ans chez les patients CCR (n = 200) avec l'enregistrement de la date du décès ou du dernier contact avec le clinicien comme point final de suivi. Pour la survie sans maladie (DFS), comme pour la survie sans événement (EFS), chez les patients atteints de CCR non métastatique au moment du diagnostic, la date de la rechute ou du dernier contact avec le clinicien était le point final du suivi. La méthode non paramétrique de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST) a été réalisée pour les courbes OS et EFS. Le calculateur de probabilité de survie génère la courbe de Kaplan-Meier avec un IC à 95 %, en utilisant le test du log-rank utilisant la distribution du Chi carré, pour comparer plus de deux groupes.

Le risque relatif de rechute de la maladie a été estimé sous forme de rapport de risque (HR). Des analyses de survie univariées ont été effectuées séparément pour le sexe, le MBI, le site de la tumeur, les antécédents familiaux de cancer, l'atteinte des ganglions lymphatiques, le stade TNM et les grades de la tumeur, pour le groupe de patients atteints de CCR ainsi que pour les génotypes de SNP LINC00511.

Niveau de signification. Une valeur bilatérale de P ≤ 0,05 a été considérée comme un signe de signification statistique.