대장암에서 긴 유전자간 비코딩 RNA 00511(LINC00511)의 유전적 변이의 의미

1. 소개

   1.1. 배경 대장암(CRC)은 이집트에서 7번째로 흔한 암입니다. CRC의 전 세계적 부담은 새로운 사례와 사망 측면에서 2030년까지 60% 증가할 것으로 예상됩니다.

   방사선 및 화학 요법을 포함한 전통적인 치료법은 다양한 바람직하지 않은 부작용과 관련이 있습니다. 한편, CRC의 5년 생존율은 ~64%이지만 전이성 CRC의 경우 12%로 떨어집니다. 따라서 신뢰할 수 있고 정확한 예후 지표의 개발이 필요합니다. 긴 비코딩 RNA(lncRNA)는 유전자 발현 조절, 단백질 합성, 후성유전학적 특징을 통해 다양한 유형의 암에서 중요한 역할을 합니다.

   긴 유전자간 ncRNA 00511(LINC00511)은 신경교종, 난소암 및 CRC와 같은 많은 암에서 발암성 기능을 발휘하는 2265bp ncRNA입니다. lncRNA의 단일 염기 다형성(SNP)은 암과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 유전적 변이체는 이러한 SNP의 위치에 따라 암 위험을 증가시키거나 감소시킬 수 있습니다. 최근 LINC00511 SNP는 중국 인구의 유방암(BC) 위험과 관련이 있었으며 현재 최고 감독자는 이집트 BC에서 LINC00511 SNP를 연구하고 있습니다. 또한 아직 연구되지 않은 CRC에서 LINC00511 SNP의 의미를 해결하기 위해 CRC 발병 기전을 이해하고 LINC00511 SNP를 질병 심각도와 연결하며 CRC 예방 및/또는 치료를 위한 새로운 목표를 발견하는 데 유용할 수 있습니다.

   1.2. 작업 목표 LINC00511 SNP(rs17780195 또는 rs9906859 및 rs1558535)와 CRC 민감성 및/또는 발병기전 사이의 연관성을 조사하고 이러한 SNP와 조직병리학적 유형, 종양 크기, 림프절 전이 및 종양 등급.

2. 과목 연구 참가자; 두 가지 주요 그룹으로 분류됩니다

   2.1. 그룹 I CRC 사례: 200명의 CRC 환자가 Mansoura 대학 병원에서 모집되었으며, 이전에 필수 기관 연구 윤리 위원회(REC) 검토 위원회 승인을 얻은 후 연구 참여에 대한 사전 동의에 서명했습니다. 표본 크기는 연구된 동일한 SNP에 따라 계산되었습니다. 관련 통계 방법에 따르면 BC의 중국 연구에서. 제외 기준; HBV, 주혈흡충증, HIV, 알코올 섭취, 갑상선 기능 장애, 염증성 질환, 당뇨병 및 심혈관 질환 환자. 화학요법 또는 방사선요법을 받았거나 GIT 수술을 받은 환자, 혈액 질환 환자, CRC 이외의 암 환자, 신경 질환, 호흡기 질환, 자궁 질환, 신장 질환, 간경화증 환자, 코르티코스테로이드의 장기간 사용 아니면 성호르몬. 또한, 데이터가 불완전하거나 조직병리학적 진단이 있는 환자.

   임상-병리학적 기준: 임상 데이터는 의료 기록 및 원본 병리 보고서에서 수집됩니다. 이 데이터는 엑셀 파일로 정리됩니다. 아래의 임상자료를 첨부된 엑셀파일과 같이 기록하고 평가하여야 합니다.

   • 모든 참가자에 대해 전체 가족력이 기록됩니다. -미국 암 합동위원회(AJCC)의 종양-절-전이(TNM) 분류를 사용하여 수행된 개별 암 병력 및 종양 임상 평가,
   • 체질량 지수(BMI), 염증 지표, 혈소판 수, CBC 및 간 기능 검사에 관한 참가자의 특성 - 결정될 암 조직병리학적 유형, 종양 크기 및 임상 병리학적 바이오마커 암태아 항원(CEA) 및 암종 항원 19.9(CA19.9), Ki-67 또는 PCNA(있는 경우) 데이터는 추가 상관 관계 및 통계 분석을 위해 환자 파일에서 수집됩니다.
   • 전이성 환자의 하위 그룹(있는 경우 또는 후속 조치가 수행될 경우) 치료 유형 및 전이 목적지 부위, 무병 생존율(DFS), 전체 생존율(OS), 전이성 환자의 생존 기간 치료 개시 시점은 임상적 이점에 대해 보편적으로 받아들여지는 직접적인 척도로 간주될 것입니다.

   2.2. 대조군: 겉보기에 건강하고 연령과 성별이 일치하며 질병을 앓고 있지 않거나 약물을 복용하지 않는 200명의 자원 봉사자. 정상적인 신장 기능과 간 효소 수준을 갖고 CRC에 대한 임상적 또는 실험실적 증거가 없는 대조군 피험자는 자신이나 친척을 위한 정기 검진 검사 또는 만성 질환 선별 국립 대통령 프로그램에서 모집되었습니다.

3. 방법론

3.1. In silico 데이터베이스 액세스:

• 국립인간게놈연구소(NHGRI)가 지원하는 HUGO 유전자 명명위원회(HGNC)가 보고서를 제공했습니다(https://www.genenames.org/). (2022년 4월 접속) 및 유전자 카드 식별을 이용한 LINC00511 유전자 식별(2022년 4월 접속). 또한 LINC00511 유전자 발현은 Expression Atlas의 GTEx(Genotype-Tissue Expression) 프로젝트의 53개 인간 조직 샘플에서 데이터 단위 TPM을 사용하여 RNA-seq에서 얻었습니다. 종 및 생물학적 조건에 따른 유전자 발현(https://www.ebi). ac.uk/gxa/home(2022년 1월 3일 액세스).
• SNP 선택: Han et al.의 이전 연구를 기반으로 합니다. 유방암에서 여러 LINC00511 SNP를 연구하고 0.05= ≥ 5% 이상의 작은 대립유전자 빈도(MAF)를 검사한 후. MAF는 IGSR(International Genome Sample Resource)에서 얻었습니다. 1000개의 게놈 데이터 https://www.ensembl.org/에서 공개 인간 변이 데이터 지원 https://www.internationalgenome.org/ 1000GENOMS:단계_3.

SNPinfo 웹 서버 http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi에 액세스하여 DNA 서열의 SNP 정보를 얻고 잠재적인 이웃에 대한 하나의 SNP 효과를 예측했습니다.

3.2. EDTA 항응고제 진공 용기에서 대조군과 CRC 환자로부터 혈액 샘플링 5ml를 수집하고 Ain Shams University 약학부(연구 환경)의 Advanced Biochemistry Research Lab(ABRL)에서 생화학적 평가까지 -80°C에 보관했습니다.

3.3. 제조업체의 지침에 따라 200 μL 전혈에서 QIAmp DNA Blood Mini 추출 키트를 사용하여 혈액에서 DNA 추출. DNA 정량화는 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, UK)에 의해 수행되었습니다.

3.4. TaqMan® SNP 유전형 분석 분석을 사용한 SNP 유전형 분석은 TaqMan Universal Master Mix No UNG(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 StepOnePlus Thermal Cycler(Applied Biosystems, 미국)를 사용하여 LINC00511 SNP(rs17780195, rs9906859 및 rs1558535)에 대한 유전형 분석을 수행하는 데 사용됩니다. ).

3.5. 통계 분석 통계 분석은 R 소프트웨어(버전 4.2.0)에서 수행되었습니다. 먼저, 연구된 각 SNP에 대한 유전자형 빈도는 Pearson의 χ 2 카이 제곱 테스트를 사용하여 Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)과 일치하는지 확인했습니다.

CRC 그룹과 대조군 간의 정량적 변수와 정성적 변수를 비교하기 위해 Student's t-test와 χ2 test를 사용했습니다. 인구통계학적 요인(나이, 성별, BMI, 1촌 친척의 암 가족력)을 조정한 후, 공동 우성, 우성, 과잉을 사용하여 조사된 LINC00511 SNP 중에서 CRC에 대한 독립적인 위험 요인을 탐색하기 위해 무조건 로지스틱 회귀를 적용했습니다. 우성 및 열성 유전형 모델을 사용하여 모델 적합성 및 예측 측정값(AIC(Akaike Information Criterion), BIC(Bayesian Information Criterion), DIC(Deviance Information Criterion), Pseudo R2(McFadden's, Cox 및 Snell's 및 Nagelkerke's)) 및 수신기 아래 영역 작동 특성(AUC) 곡선. 추가/공동 지배 모델은 이러한 기준에 따른 모든 모델보다 우수했습니다. (단순한 질병 진단이 아닌) 가장 적합하고 예측력이 좋은 모델에 대해 민감도(SN), 특이도(SP), 양성 예측값(PPV) 및 음성 예측값(NPV)이 보고되었습니다. LINC00511 SNP의 연령, CA19-9 및 CEA 분류에 대한 최적의 컷오프는 ROC 분석을 사용하여 결정되었습니다. BMI는 과체중 및 비만 개인의 표준 정의에 따라 분류되었습니다(BMI ≥ 25kg/m2인 대상은 과체중 또는 비만으로 간주됨). SNP 유전자형은 R의 snpReady 라이브러리를 사용하여 분석되었습니다(Granato et al., 2018)[누락된 유전자형은 Wright의 방법(Wright의 평형 기반)을 사용하여 귀속되었으며 누락된 기본 인구통계 및 임상 데이터는 R에서 구현된 예측 평균 일치 방법을 사용하여 귀속되었습니다. (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

기준선 공변량(연령, BMI, 종양 단계 및 종양 등급에 대한 추가 위험 인자, 환자 암 가족력, 종양 부위, IBD 병력), 전형적인 종양 표지자(CEA 및 CA19.9) 및 혈관 침윤의 유무를 확인합니다.

하나 이상의 변수에서 준분리의 경우 Firth의 로지스틱 회귀가 구현되었습니다. Haploview 소프트웨어 버전 2.0을 사용하여 r2 및 D'를 계산했는데, 이는 서로 다른 유전자형의 쌍별 SNP 조합 블록 사이의 연관 불균형 범위 측정이 SHEsis 소프트웨어 http://analytic.bio-x.cn/myAnalytic.php를 사용하여 결정되었기 때문입니다. 계층화 분석 및 SHEsis plus 온라인 소프트웨어 http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html LINC00511 SNP와 CRC 감수성 및 일배체형 빈도 사이의 연관성을 추가로 평가하기 위해 적용되었으며 유전적 분포 측정은 CRC 및 건강한 대조군에서 직접 계산되었습니다. 또한 SNP-SNP 또는 유전자-유전자 및 SNP-환경 또는 유전자-환경 상호작용 분석을 수행하기 위해 R https://ritchielab.org/software/mdr-download의 MDR(Multifactor Dimensionality Reduction) 패키지 소프트웨어를 통해 Epistatic을 분석했습니다. 유전적 요인과 인구통계학적 요인의 상호작용적 역할을 평가하기 위해 적용됨(가짜 발견 비율은 Benjamini 및 Hochberg, Benjamini 및 Yekutieli, Holm 스텝다운, Sidak 스텝다운 및 Sidak 단일 단계 p-값 조정을 사용하여 유의 수준을 조정하여 제어됨) 절차). MDR 부분 외에도 의사 R 제곱 측정값과 ROC 곡선별 SN, SP, PPV 및 NPV를 사용하여 모델의 예측 능력을 비교할 때 LINC00511 SNP rs 예측에 도움이 됩니다. 예측 방법 LD 값은 동일한 샘플과 주어진 창 내에서 유전자형이 분석된 LINC00511 SNP 간의 쌍별 추정을 통해 계산되었습니다. 각각의 가능한 일배체형이 이중 이형접합체에 기여하는 비율의 최대 가능성을 추정하기 위해 확립된 방법이 사용되었습니다.

환자 그룹에서 얻은 결과 간의 차이가 우연이 아닌지 확인하기 위해 Bonferroni 계산을 데이터에 적용했습니다.

마지막으로 연구자들은 사망일 또는 임상의와의 마지막 접촉일을 추적 종료일로 기록하여 CRC 환자(n=200)의 2년 동안 전체 생존 기간(OS)을 분석했습니다. 무병 생존(DFS)과 무사건 생존(EFS)의 경우, 진단 당시 비전이성 대장암 환자의 경우 재발 날짜 또는 임상의와의 마지막 접촉 날짜를 추적 관찰 종료점으로 삼았습니다. 비모수적 Kaplan-Meier 방법(PROC LIFETEST)은 OS 곡선과 EFS에 대해 수행되었습니다. 생존 확률 계산기는 두 그룹 이상의 비교를 위해 카이 제곱 분포를 이용한 로그 순위 테스트를 사용하여 95% CI의 Kaplan-Meier 곡선을 생성합니다.

질병 재발의 상대적 위험은 위험비(HR)로 추정되었습니다. CRC 환자 그룹뿐만 아니라 LINC00511 SNP 유전자형에 대해 성별, MBI, 종양 부위, 암 가족력, 림프절 침범, TNM 단계 및 종양 등급에 대해 개별적으로 단변량 생존 분석을 수행했습니다.

유의성 수준. P ≤ 0.05의 양면 값은 통계적 유의성의 징후로 간주되었습니다.