Implicazione delle variazioni genetiche nell'RNA non codificante intergenico lungo 00511 (LINC00511) nel cancro del colon-retto

1. introduzione

   1.1. Background Il cancro del colon-retto (CRC) rappresenta il settimo tumore più comune in Egitto. Si prevede che il peso globale della CRC aumenterà del 60%, entro il 2030, in termini di nuovi casi e decessi.

   I trattamenti tradizionali, comprese la radioterapia e la chemioterapia, sono associati a vari effetti collaterali indesiderati. Nel frattempo, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per il CRC è di circa il 64%, ma scende al 12% per il CRC metastatico. Pertanto, è necessario lo sviluppo di marcatori prognostici affidabili e accurati. Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) svolgono un ruolo importante in diversi tipi di cancro attraverso la regolazione dell'espressione genica e della sintesi proteica, essendo firme epigenetiche.

   L'ncRNA intergenico lungo 00511 (LINC00511) è un ncRNA da 2265 bp che esercita una funzione oncogenica in molti tumori, come il glioma, il cancro ovarico e il CRC. È stato scoperto che i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) negli lncRNA sono associati al cancro. Tali varianti genetiche possono aumentare o ridurre il rischio di cancro a seconda della posizione di questi SNP. Recentemente, gli SNP LINC00511 sono stati associati al rischio di cancro al seno (BC) nella popolazione cinese e attualmente il supervisore capo sta studiando gli SNP LINC00511 nel BC egiziano. Inoltre, affrontare le implicazioni degli SNP LINC00511 nel CRC, non ancora studiati, potrebbe essere utile per comprendere la patogenesi del CRC, collegare gli SNP LINC00511 alla gravità della malattia, nonché per scoprire nuovi bersagli per la prevenzione e/o il trattamento del CRC.

   1.2. Scopo del lavoro Studio dell'associazione tra SNP LINC00511 (rs17780195 o rs9906859 e rs1558535) e sensibilità e/o patogenesi del CRC oltre a scoprire l'interazione tra questi SNP e fattori clinicopatologici quali tipo istopatologico, dimensione del tumore, metastasi linfonodali e grado del tumore.

2. Soggetti Partecipanti allo studio; saranno classificati in due gruppi principali

   2.1. Casi di CRC del gruppo I: 200 pazienti con CRC sono stati reclutati dagli ospedali universitari di Mansoura, precedentemente firmati un consenso informato per partecipare allo studio dopo aver ottenuto l'approvazione del comitato di revisione del comitato etico della ricerca istituzionale (REC) richiesta, la dimensione del campione è stata calcolata in base agli stessi SNP studiati in BC in uno studio cinese, secondo i metodi statistici pertinenti. Criteri di esclusione; pazienti con HBV, schistosomiasi, HIV, consumo di alcol, disfunzione tiroidea, malattie infiammatorie, diabete mellito e disturbi cardiovascolari. Soggetti sottoposti a chemioterapia o radioterapia o che hanno subito un intervento chirurgico GIT, pazienti con malattie del sangue, qualsiasi cancro diverso dal CRC, pazienti con malattie neuronali, malattie respiratorie, malattie uterine, malattie renali, cirrosi epatica, uso prolungato di corticosteroidi o ormoni sessuali. Inoltre, pazienti con dati incompleti o diagnosi istopatologica.

   Criteri clinico-patologici: i dati clinici saranno ottenuti dalle cartelle cliniche e dai referti patologici originali. Questi dati devono essere compilati in un file Excel. I seguenti dati clinici da registrare e valutare come nel file excel allegato.

   • L'anamnesi familiare completa sarà registrata per tutti i partecipanti, - Anamnesi individuale del cancro e valutazione clinica del tumore effettuata utilizzando la classificazione tumore-nodo-metastasi (TNM) dell'American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • Le caratteristiche dei partecipanti per quanto riguarda l'indice di massa corporea (BMI), i marcatori di infiammazione, la conta piastrinica, l'emocromo e i test di funzionalità epatica, il tipo istopatologico del cancro da determinare, le dimensioni del tumore, nonché i biomarcatori clinico-patologici carcinoembrionali antigene (CEA) e antigene del carcinoma 19.9 (CA19.9), I dati Ki-67 o PCNA (se presenti) verranno raccolti dai file dei pazienti per ulteriori correlazioni e analisi statistiche,
   • Per il sottogruppo di pazienti metastatici (se presente o se verrà effettuato un follow-up), tipo di trattamento e sede di destinazione della metastasi, sopravvivenza libera da malattia (DFS), sopravvivenza globale (OS), durata della sopravvivenza del paziente dal momento di inizio del trattamento, sarà considerato una misura diretta universalmente accettata del beneficio clinico.

   2.2. Gruppo di controllo: apparentemente sani, corrispondenti per età e sesso, 200 volontari, che non soffrivano di alcuna malattia né assumevano alcun farmaco. Soggetti di controllo con funzionalità renale e livelli di enzimi epatici normali, assenza di qualsiasi evidenza clinica o di laboratorio di CRC, sono stati reclutati durante esami di controllo di routine per se stessi o i loro parenti o dal Programma presidenziale nazionale di screening delle malattie croniche.

3. Metodologia

3.1. Accesso ai database in silico:

• Il Comitato per la nomenclatura dei geni HUGO (HGNC), supportato dal National Human Genome Research Institute (NHGRI), ha fornito un rapporto https://www.genenames.org/ (accesso ad aprile 2022) e identificazione del gene LINC00511 mediante l'identificazione della scheda genetica (accesso ad aprile 2022). Inoltre, l'espressione genica LINC00511 è stata ottenuta da RNA-seq utilizzando l'unità dati TPM, da 53 campioni di tessuto umano del progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) da Expression Atlas Espressione genica attraverso specie e condizioni biologiche https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (visitato il 3 gennaio 2022).
• Selezione SNP: sulla base del precedente studio di Han et al. che hanno studiato diversi SNP LINC00511 nel cancro al seno e dopo lo screening per una frequenza allelica minore (MAF) superiore a 0,05= ≥ 5%. Il MAF è stato ottenuto dall'International Genome Sample Resource (IGSR) che supporta dati aperti sulla variazione umana https://www.internationalgenome.org/ in 1000 dati sui genomi https://www.ensembl.org/ 1000GENOMI:fase_3.

Server Web SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- È stato effettuato l'accesso a bin/snpinfo/snpfunc.cgi per ottenere informazioni SNP nella sequenza del DNA e per prevedere un effetto SNP sui potenziali vicini.

3.2. Campionamento di sangue 5 ml raccolti da controlli e pazienti con CRC, su contenitori vacutainer anticoagulanti EDTA e conservati a -80º C, fino alla valutazione biochimica presso l'Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams (ambiente di ricerca).

3.3. Estrazione del DNA dal sangue utilizzando un kit di estrazione QIAmp DNA Blood Mini da 200 μL di sangue intero, secondo le istruzioni del produttore. La quantificazione del DNA è stata eseguita da NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Regno Unito).

3.4. La genotipizzazione degli SNP utilizzando il test di genotipizzazione TaqMan® SNP verrà utilizzata per eseguire la genotipizzazione degli SNP LINC00511 (rs17780195, rs9906859 e rs1558535) utilizzando TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) e StepOnePlus Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA ).

3.5. Analisi statistica L'analisi statistica è stata eseguita nel software R (versione 4.2.0). Innanzitutto, le frequenze genotipiche per ciascun SNP studiato sono state controllate per essere in concordanza con l'equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE) utilizzando i test Chi-quadrato χ 2 di Pearson.

Il test t di Student e il test χ2 sono stati utilizzati per confrontare le variabili quantitative e qualitative rispettivamente tra il gruppo CRC e quello di controllo. Dopo aver aggiustato i fattori demografici (età, sesso, indice di massa corporea, storia familiare di cancro nei parenti di primo grado), è stata applicata una regressione logistica incondizionata per esplorare i fattori di rischio indipendenti per CRC tra gli SNP LINC00511 esaminati utilizzando il co-dominante, dominante, sovra- modelli genotipici dominanti e recessivi, quindi confrontati utilizzando misure di adattamento e previsione del modello (Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFadden, Cox e Snell e Nagelkerke)) e la curva delle caratteristiche operative dell'area sotto il ricevitore (AUC). Il modello additivo/codominante era superiore a tutti i modelli basati su questi criteri. Sensibilità (SN), specificità (SP), valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV) sono stati riportati per il modello con il miglior adattamento e potere predittivo (non per la semplice diagnosi della malattia). I cut-off ottimali per età, CA19-9 e categorizzazione CEA degli SNP LINC00511 sono stati determinati utilizzando l'analisi ROC. Il BMI è stato classificato in base alle definizioni standard di individui in sovrappeso e obesi (i soggetti con BMI ≥ 25 kg/m2 sono stati considerati sovrappeso o obesi). I genotipi degli SNP sono stati analizzati utilizzando la libreria snpReady in R (Granato et al., 2018) [i genotipi mancanti sono stati imputati utilizzando il metodo di Wright (basato sull'equilibrio di Wright) e i dati demografici e clinici di base mancanti sono stati imputati utilizzando il metodo di corrispondenza media predittiva implementato in R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

È stata effettuata un'analisi di regressione logistica multipla per esaminare l'associazione tra ciascun allele SNP, genotipi, aplotipi e prevalenza, stadio e grado del CRC, aggiustando per le covariate al basale (età, BMI e fattori di rischio aggiuntivi per stadio e grado del tumore, pazienti ' storia familiare di cancro, sede del tumore, storia di IBD), marcatori tumorali classici (CEA e CA19.9) e presenza o assenza di infiltrazione vascolare.

La regressione logistica di Firth è stata implementata nel caso di quasi-separazione in una o più variabili. Il software Haploview versione 2.0 è stato utilizzato per calcolare r2 e D' poiché le misurazioni dell'entità del disequilibrio del collegamento tra blocchi di combinazioni SNP a coppie di diversi genotipi sono state determinate utilizzando il software SHEsis http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Un'analisi stratificata e il software online SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html applicato per valutare ulteriormente l'associazione tra SNP LINC00511 e suscettibilità al CRC, nonché la frequenza degli aplotipi poiché una misurazione della distribuzione genetica è stata calcolata direttamente nel CRC e nei gruppi di controllo sani. Inoltre, Epistasis è stata analizzata dal software del pacchetto Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) in R https://ritchielab.org/software/mdr-download per eseguire analisi di interazione SNP-SNP o gene-gene e SNP-Ambiente o gene-ambiente, applicato per valutare il ruolo interattivo dei fattori genetici e demografici (il tasso di falsa scoperta è stato controllato aggiustando il livello di significatività utilizzando Benjamini e Hochberg, Benjamini e Yekutieli, Holm step-down, Sidak step-down e Sidak single-step p-value adjustment procedure). Quando si confronta la capacità predittiva dei modelli utilizzando le misure pseudo-R quadrato e la curva SN, SP, PPV e NPV mediante ROC, oltre alla parte MDR, si aiuta la previsione rs degli SNP LINC00511. I valori LD del metodo di previsione sono stati calcolati mediante una stima a coppie tra SNP LINC00511 genotipizzati nello stesso campione e all'interno di una determinata finestra. È stato utilizzato un metodo consolidato per stimare la massima probabilità della proporzione in cui ciascun possibile aplotipo ha contribuito al doppio eterozigote.

Per confermare che le differenze tra i risultati ottenuti nel gruppo di pazienti non erano casuali, ai dati è stato applicato un calcolo Bonferroni.

Infine, i ricercatori hanno analizzato la sopravvivenza globale (OS) per 2 anni nei pazienti con CRC (n = 200) registrando la data di morte o l'ultimo contatto con il medico come punto finale di follow-up. Per la sopravvivenza libera da malattia (DFS), come sopravvivenza libera da eventi (EFS), nei pazienti con CRC non metastatico al momento della diagnosi, la data della recidiva o l'ultimo contatto con il medico era l'endpoint del follow-up. Il metodo non parametrico Kaplan-Meier (PROC LIFETEST) è stato eseguito per le curve OS ed EFS. Il calcolatore della probabilità di sopravvivenza genera la curva di Kaplan-Meier con IC al 95%, utilizzando il test dei ranghi logaritmici utilizzando la distribuzione Chi quadrato, per il confronto di più di due gruppi.

Il rischio relativo di recidiva della malattia è stato stimato come rapporto di rischio (HR). Sono state effettuate analisi di sopravvivenza univariabili per sesso, MBI, sede del tumore, storia familiare di cancro, coinvolgimento dei linfonodi, stadio TNM e gradi del tumore separatamente, per il gruppo di pazienti con CRC e per i genotipi SNP LINC00511.

Livello di significatività. Un valore bilaterale di P ≤ 0,05 è stato considerato un segno di significatività statistica.