Implikacje zmian genetycznych w długim międzygenowym niekodującym RNA 00511 (LINC00511) w raku jelita grubego

1. Wstęp

   1.1. Tło Rak jelita grubego (CRC) jest siódmym pod względem częstości występowania nowotworem w Egipcie. Oczekuje się, że globalne obciążenie CRC wzrośnie o 60% do 2030 r. pod względem nowych przypadków i zgonów.

   Tradycyjne metody leczenia, w tym radio- i chemioterapia, wiążą się z różnymi niepożądanymi skutkami ubocznymi. Tymczasem wskaźnik przeżycia 5-letniego w przypadku CRC wynosi ~ 64%, ale spada do 12% w przypadku CRC z przerzutami. Dlatego konieczne jest opracowanie wiarygodnych i dokładnych markerów prognostycznych. Długie niekodujące RNA (lncRNA) odgrywają ważną rolę w różnych typach nowotworów poprzez regulację ekspresji genów, syntezę białek, będąc sygnaturami epigenetycznymi.

   Długi międzygenowy ncRNA 00511 (LINC00511) to ncRNA o długości 2265 bp, który pełni funkcję onkogenną w wielu nowotworach, takich jak glejak, rak jajnika i CRC. Stwierdzono, że polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) w lncRNA są powiązane z rakiem. Takie warianty genetyczne mogą zwiększać lub zmniejszać ryzyko raka w zależności od lokalizacji tych SNP. Niedawno SNP LINC00511 powiązano z ryzykiem raka piersi (BC) w populacji chińskiej, a obecnie główny kierownik bada SNP LINC00511 w egipskiej BC. Co więcej, zajęcie się wpływem SNP LINC00511 na CRC, które nie jest jeszcze badane, może być przydatne do zrozumienia patogenezy CRC, powiązania SNP LINC00511 z ciężkością choroby, a także do odkrycia nowego celu zapobiegania i/lub leczenia CRC.

   1.2. Cel pracy Badanie związku pomiędzy SNP LINC00511 (rs17780195 lub rs9906859 i rs1558535) a podatnością na CRC i/lub patogenezą, a także poznanie interakcji pomiędzy tymi SNP a czynnikami kliniczno-patologicznymi, takimi jak typ histopatologiczny, wielkość guza, przerzuty do węzłów chłonnych i stopień nowotworu.

2. Przedmioty Uczestnicy badania; zostaną podzielone na dwie główne grupy

   2.1. Grupa I Przypadki CRC: 200 pacjentów z CRC zrekrutowano ze szpitali uniwersyteckich w Mansoura, którzy wcześniej podpisali świadomą zgodę na udział w badaniu po uzyskaniu wymaganej zgody komisji rewizyjnej komisji ds. etyki badań instytucjonalnych (REC). Wielkość próby obliczono zgodnie z tymi samymi badanymi SNP w BC w chińskim badaniu, zgodnie z odpowiednimi metodami statystycznymi. Kryteria wyłączenia; pacjenci z HBV, schistosomatozą, HIV, spożywaniem alkoholu, dysfunkcją tarczycy, chorobami zapalnymi, cukrzycą i chorobami układu krążenia. Pacjenci otrzymujący jakąkolwiek chemioterapię lub radioterapię lub przeszli operację chirurgiczną przewodu pokarmowego, pacjenci z chorobami krwi, dowolnym nowotworem innym niż CRC, pacjenci z chorobami neuronalnymi, chorobami układu oddechowego, chorobami macicy, chorobami nerek, marskością wątroby, długotrwałym stosowaniem kortykosteroidów lub hormony płciowe. Dodatkowo pacjenci z niekompletnymi danymi lub rozpoznaniem histopatologicznym.

   Kryteria kliniczno-patologiczne: Dane kliniczne zostaną uzyskane z dokumentacji medycznej i oryginalnych raportów patologicznych. Dane te należy skompilować w pliku Excel. Następujące dane kliniczne należy zapisać i ocenić zgodnie z załączonym plikiem Excel.

   • W przypadku wszystkich uczestników zostanie zarejestrowany pełny wywiad rodzinny, -Indywidualna historia nowotworu i ocena kliniczna guza przeprowadzona przy użyciu klasyfikacji przerzutów do węzłów chłonnych (TNM) Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (AJCC),
   • Charakterystyka uczestników pod względem wskaźnika masy ciała (BMI), markera(ów) stanu zapalnego, liczby płytek krwi, morfologii krwi i testów czynności wątroby, -typu histopatologicznego nowotworu do ustalenia, wielkości guza oraz biomarkerów kliniczno-patologicznych rakowo-embrionalnych antygen (CEA) i antygen raka 19.9 (CA19.9), Z akt pacjenta zostaną pobrane dane Ki-67 lub PCNA (jeśli istnieją) w celu dalszych korelacji i analizy statystycznej,
   • W przypadku podgrupy pacjentów z przerzutami (jeśli istnieje lub jeśli zostaną przeprowadzone badania kontrolne) rodzaj leczenia i miejsce docelowe przerzutów, przeżycie wolne od choroby (DFS), przeżycie całkowite (OS), czas przeżycia pacjenta od momentu rozpoczęcia leczenia, będzie uważany za powszechnie akceptowaną bezpośrednią miarę korzyści klinicznej.

   2.2. Grupa kontrolna: pozornie zdrowi, dobrani pod względem wieku i płci, 200 ochotników, nie cierpiących na żadną chorobę ani nie przyjmujących żadnych leków. Osoby kontrolne z prawidłową czynnością nerek i poziomem enzymów wątrobowych, bez żadnych klinicznych lub laboratoryjnych dowodów na CRC, rekrutowano podczas rutynowych badań kontrolnych dla nich samych lub ich krewnych lub z Krajowego Prezydenckiego Programu Badań Przesiewowych Chorób Przewlekłych.

3. Metodologia

3.1. Dostęp do baz danych in silico:

• Komitet ds. Nomenklatury Genów HUGO (HGNC) wspierany przez Narodowy Instytut Badań nad Genomem Człowieka (NHGRI) przedstawił raport https://www.genenames.org/ (dostęp: kwiecień 2022) oraz identyfikacja genu LINC00511 za pomocą identyfikacji karty genowej (dostęp: kwiecień 2022). Ponadto ekspresję genu LINC00511 uzyskano z seq RNA przy użyciu jednostki danych TPM z 53 próbek tkanek ludzkich z projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) z Expression Atlas Ekspresja genów w różnych gatunkach i warunkach biologicznych https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (dostęp: 3 stycznia 2022 r.).
• Wybór SNP: Na podstawie poprzedniego badania Hana i in. którzy badali kilka SNP LINC00511 w raku piersi i po badaniu przesiewowym pod kątem częstości alleli drugorzędnych (MAF) powyżej 0,05= ≥ 5%. MAF uzyskano z Międzynarodowego Zasobu Próbek Genomu (IGSR) Wspierającego otwarte dane dotyczące zmienności ludzkiej https://www.internationalgenome.org/ w danych 1000 genomów https://www.ensembl.org/ 1000GENOMÓW:faza_3.

Serwer internetowy SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- Uzyskano dostęp do pliku bin/snpinfo/snpfunc.cgi w celu uzyskania informacji o SNP w sekwencji DNA i przewidzenia wpływu jednego SNP na potencjalnych sąsiadów.

3.2. Próbki krwi 5 ml pobrane od kontroli i pacjentów z CRC, w pojemnikach próżniowych z antykoagulantem EDTA i przechowywane w temperaturze -80°C, do czasu oceny biochemicznej w Laboratorium Zaawansowanych Badań Biochemicznych (ABRL), Wydział Farmacji, Uniwersytet Ain Shams (miejsce badawcze).

3.3. Ekstrakcja DNA z krwi przy użyciu zestawu do ekstrakcji QIAmp DNA Blood Mini z 200 µl krwi pełnej, zgodnie z instrukcją producenta. Kwantyfikację DNA przeprowadzono za pomocą NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania).

3.4. Genotypowanie SNP przy użyciu testu genotypowania SNP TaqMan® zostanie wykorzystane do przeprowadzenia genotypowania SNP LINC00511 (rs17780195, rs9906859 i rs1558535) przy użyciu TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) i termocyklera StepOnePlus (Applied Biosystems, USA) ).

3.5. Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzono w programie R (wersja 4.2.0). Najpierw sprawdzono, czy częstości genotypów dla każdego badanego SNP są zgodne z równowagą Hardy'ego-Weinberga (HWE), stosując testy chi-kwadrat Pearsona χ2.

Do porównania zmiennych ilościowych i jakościowych odpowiednio pomiędzy grupą CRC a grupą kontrolną wykorzystano test t-Studenta i test Chi2. Po uwzględnieniu czynników demograficznych (wiek, płeć, BMI, występowanie nowotworów w rodzinie u krewnych pierwszego stopnia) zastosowano bezwarunkową regresję logistyczną w celu zbadania niezależnych czynników ryzyka CRC wśród badanych SNP LINC00511 przy użyciu współdominującego, dominującego, nadmiernie dominujące i recesywne modele genotypowe, a następnie porównywane przy użyciu miar dopasowania i przewidywania modelu (kryterium informacyjne Akaikego (AIC), kryterium informacyjne Bayesa (BIC), kryterium informacji o odchyleniach (DIC), pseudo R2 (McFaddena, Coxa i Snella oraz Nagelkerke’a) oraz krzywą charakterystyki operacyjnej obszaru pod odbiornikiem (AUC). Model addytywny/współdominujący był lepszy od wszystkich modeli opartych na tych kryteriach. Czułość (SN), swoistość (SP), dodatnią wartość predykcyjną (PPV) i ujemną wartość przewidywaną (NPV) podano dla modelu o najlepszym dopasowaniu i mocy predykcyjnej (nie w przypadku zwykłej diagnozy choroby). Optymalne wartości graniczne dla wieku, CA19-9 i kategoryzacji CEA SNP LINC00511 określono za pomocą analizy ROC. Kategoryzację BMI przeprowadzono w oparciu o standardowe definicje osób z nadwagą i otyłością (osoby z BMI ≥ 25 kg/m2 uznawano za osoby z nadwagą lub otyłością). Genotypy SNP analizowano przy użyciu biblioteki snpReady w R (Granato i in., 2018) [brakujące genotypy przypisywano metodą Wrighta (w oparciu o równowagę Wrighta), a brakujące wyjściowe dane demograficzne i kliniczne przypisywano przy użyciu metody przewidywania średniego dopasowania wdrożonej w R (van Buuren i Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Przeprowadzono wielokrotną analizę regresji logistycznej w celu zbadania powiązania między każdym allelem, genotypem, haplotypem SNP a częstością występowania, stadium i stopnia CRC, przy uwzględnieniu wyjściowych współzmiennych (wiek, BMI i dodatkowe czynniki ryzyka dla stadium nowotworu i stopnia zaawansowania nowotworu, liczba pacjentów wywiad rodzinny dotyczący nowotworu, lokalizacja guza, historia IBD), klasyczne markery nowotworowe (CEA i CA19.9) oraz obecność lub brak nacieku naczyniowego.

W przypadku quasi-separacji jednej lub większej liczby zmiennych zastosowano regresję logistyczną Firtha. Do obliczenia r2 i D' wykorzystano oprogramowanie Haploview w wersji 2.0, ponieważ pomiary stopnia nierównowagi powiązań pomiędzy parami kombinacji bloków SNP o różnych genotypach określono przy użyciu oprogramowania SHEsis http://analytics.bio-x.cn/myAnalytics.php. Analiza warstwowa i oprogramowanie SHEsis plus online http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html zastosowane do dalszej oceny powiązania między SNP LINC00511 a podatnością na CRC, a także częstość występowania haplotypów jako miarę rozkładu genetycznego obliczono bezpośrednio w CRC i zdrowych grupach kontrolnych. Ponadto epistazę analizowano za pomocą pakietu oprogramowania Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) w R https://ritchielab.org/software/mdr-download w celu przeprowadzenia analizy interakcji SNP-SNP lub gen-gen i SNP-Environment lub gen-środowisko, zastosowano do oceny interaktywnej roli czynników genetycznych i demograficznych (wskaźnik fałszywych odkryć kontrolowano poprzez dostosowanie poziomu istotności za pomocą Benjaminiego i Hochberga, Benjaminiego i Yekutieli, obniżania Holma, obniżania Sidaka i jednostopniowej korekty wartości p Sidaka procedury). Porównując zdolność predykcyjną modeli wykorzystujących miary pseudo-R-kwadrat oraz SN, SP, PPV i NPV według krzywej ROC, oprócz części MDR, pomaga w przewidywaniu rs SNP LINC00511. Metodę przewidywania Wartości LD obliczono poprzez estymację parami pomiędzy genotypowanymi SNP LINC00511 w tej samej próbce i w danym oknie. Do oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa proporcji, w jakiej każdy możliwy haplotyp przyczynił się do podwójnej heterozygoty, zastosowano ustaloną metodę.

Aby potwierdzić, że różnice pomiędzy uzyskanymi wynikami w grupie pacjentów nie są przypadkowe, do danych zastosowano kalkulację Bonferroniego.

Na koniec badacze przeanalizowali przeżycie całkowite (OS) przez 2 lata u pacjentów z CRC (n=200), odnotowując datę śmierci lub ostatniego kontaktu z lekarzem jako punkt końcowy obserwacji. W przypadku przeżycia wolnego od choroby (DFS), jako przeżycia wolnego od zdarzeń (EFS), u pacjentów z CRC bez przerzutów w momencie rozpoznania punktem końcowym obserwacji była data nawrotu choroby lub ostatni kontakt z lekarzem. Dla krzywych OS i EFS wykonano nieparametryczną metodę Kaplana-Meiera (PROC LIFETEST). Kalkulator prawdopodobieństwa przeżycia generuje krzywą Kaplana-Meiera z 95% CI, stosując test log-rank z wykorzystaniem rozkładu Chi-kwadrat, w celu porównania więcej niż dwóch grup.

Względne ryzyko nawrotu choroby oszacowano jako współczynnik ryzyka (HR). Analizy przeżycia jednozmiennego przeprowadzono oddzielnie dla płci, MBI, umiejscowienia guza, wywiadu rodzinnego w kierunku nowotworu, zajęcia węzłów chłonnych, stopnia zaawansowania TNM i stopnia nowotworu oddzielnie, dla grupy pacjentów z CRC, a także dla genotypów SNP LINC00511.

Poziom istotności. Za znak istotności statystycznej uznano dwustronną wartość P ≤ 0,05.