Implikation af genetiske variationer i lang intergenisk ikke-kodende RNA 00511 (LINC00511) i kolorektal cancer

1. Introduktion

   1.1. Baggrund Kolorektal cancer (CRC) repræsenterer den 7. mest almindelige cancer i Egypten. Den globale byrde af CRC forventes at stige med 60 % i 2030 i form af nye tilfælde og dødsfald.

   Traditionelle behandlinger, herunder radio- og kemoterapier, er forbundet med forskellige uønskede bivirkninger. I mellemtiden er 5-års overlevelsesraten for CRC ~ 64%, men falder til 12% for metastatisk CRC. Derfor er udvikling af pålidelige og nøjagtige prognostiske markører nødvendig. Lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) spiller en vigtig rolle i forskellige typer kræft gennem regulering af genekspression, proteinsyntese, som er epigenetiske signaturer.

   Long intergenic ncRNA 00511 (LINC00511) er et 2265 bp ncRNA, der udøver en onkogen funktion i mange kræftformer, såsom gliom, ovariecancer og CRC. Enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) i lncRNA'er har vist sig at være forbundet med cancer. Sådanne genetiske varianter kan øge eller reducere risikoen for cancer afhængigt af placeringen af ​​disse SNP'er. For nylig var LINC00511 SNP'er forbundet med risiko for brystkræft (BC) i den kinesiske befolkning, og i øjeblikket studerer den øverste vejleder LINC00511 SNP'er i egyptisk BC. For at adressere implikationen af ​​LINC00511 SNP'er i CRC, som endnu ikke er undersøgt, kan det være nyttigt til at forstå CRC-patogenese, forbinde LINC00511 SNP'er til sygdoms sværhedsgrad samt til at opdage nyt mål for CRC-forebyggelse og/eller behandling.

   1.2. Formålet med arbejdet Undersøgelse af sammenhængen mellem LINC00511 SNP'er (rs17780195 eller rs9906859 og rs1558535) og CRC-modtagelighed og/eller patogenese udover at finde ud af interaktionen mellem disse SNP'er og klinikopatologiske faktorer, såsom tumorstørrelse, histosta, patologiske faktorer og tumorstørrelsespatologiske faktorer. tumorgrad.

2. Fagstudiedeltagere; vil blive opdelt i to hovedgrupper

   2.1. Gruppe I CRC-tilfælde: 200 CRC-patienter blev rekrutteret fra Mansoura University Hospitals, der tidligere har underskrevet et informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen efter at have opnået den krævede institutionelle forskningsetiske komités (REC) review board-godkendelse. Prøvestørrelsen blev beregnet i henhold til de samme SNP'er, der blev undersøgt i BC i en kinesisk undersøgelse, ifølge de relevante statistiske metoder. Eksklusionskriterier; patienter med HBV, schistosomiasis, HIV, alkoholindtag, skjoldbruskkirteldysfunktion, betændelsessygdomme, diabetes mellitus og kardiovaskulære lidelser. Forsøgspersoner, der fik kemoterapi eller strålebehandling eller havde gennemgået en GIT-kirurgi, patienter med blodsygdomme, andre kræftformer end CRC, patienter med neuronale sygdomme, luftvejssygdomme, livmodersygdomme, nyresygdomme, skrumpelever, langvarig brug af kortikosteroider eller kønshormoner. Derudover patienter med ufuldstændige data eller histopatologisk diagnose.

   Klinisk-patologiske kriterier: Kliniske data vil blive indhentet fra lægejournaler og de originale patologirapporter. Disse data skal kompileres i en excel-fil. Følgende kliniske data skal registreres og vurderes som i den vedhæftede excel-fil.

   • Fuld familiehistorie vil blive registreret for alle deltagere, -Individuel kræfthistorie og den kliniske tumorvurdering udført ved hjælp af tumor-node-metastasis (TNM) klassificeringen af ​​American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • Deltagernes karakteristika med hensyn til kropsmasseindeks (BMI), inflammationsmarkør(er), antal blodplader, CBC og leverfunktionstests, -Cancer histopatologisk type, der skal bestemmes, tumorstørrelse, samt klinisk-patologiske biomarkører carcinoembryonale antigen (CEA) og carcinomantigen 19.9 (CA19.9), Ki-67 eller PCNA (hvis nogen) data vil blive indsamlet fra patientfiler til yderligere korrelationer og statistisk analyse,
   • For de metastatiske patienters undergruppe (hvis nogen, eller hvis der vil blive fulgt op) behandlingstype og stedet for metastatisk destination, sygdomsfri overlevelse (DFS), samlet overlevelse (OS), varigheden af ​​patientens overlevelse fra tidspunkt for behandlingsstart, vil blive betragtet som et universelt accepteret direkte mål for klinisk fordel.

   2.2. Kontrolgruppe: tilsyneladende rask, alder og køn matchede, 200 frivillige, lider ikke af nogen sygdom eller tager nogen medicin. Kontrolpersoner med normale nyrefunktioner og leverenzymniveauer, fravær af kliniske eller laboratoriebeviser for CRC, blev rekrutteret under rutinemæssige kontrolundersøgelser for dem selv eller deres pårørende eller fra Chronic Diseases Screening National Presidential Program.

3. Metode

3.1. I silico databaser adgang:

• HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) støttet af National Human Genome Research Institute (NHGRI) leverede en rapport https://www.genenames.org/ (tilgået april 2022) og identifikation af LINC00511-genet ved hjælp af genkortidentifikation (tilgået april 2022). Derudover blev LINC00511 genekspression opnået fra RNA-seq ved hjælp af dataenhed TPM, fra 53 humane vævsprøver fra Genotype-Tissue Expression (GTEx) Project fra Expression Atlas Genekspression på tværs af arter og biologiske forhold https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (tilgået 3. januar 2022).
• SNP-selektion: Baseret på den tidligere undersøgelse af Han et al. som undersøgte flere LINC00511 SNP'er i brystkræft og efter screening for en mindre allelfrekvens (MAF) over 0,05= ≥ 5 %. MAF blev opnået fra International Genome Sample Resource (IGSR) Supporting open human variation data https://www.internationalgenome.org/ i 1000 genomer data https://www.ensembl.org/ 1000GENOMER:fase_3.

SNPinfo webserver http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi blev tilgået for at opnå SNP-info i DNA-sekvens og for at forudsige en SNP-effekt på potentielle naboer.

3.2. Blodprøvetagning 5 ml indsamlet fra kontroller og CRC-patienter, på EDTA antikoagulerende vacutainere og opbevaret ved -80ºC, indtil biokemisk vurdering på Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Det farmaceutiske fakultet, Ain Shams University (forskningsmiljø).

3.3. DNA-ekstraktion fra blod ved hjælp af et QIAmp DNA Blood Mini-ekstraktionssæt fra 200 μL fuldblod i henhold til producentens instruktioner. DNA-kvantificering blev udført af NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, UK).

3.4. SNP'er Genotyping ved hjælp af TaqMan® SNP-genotypebestemmelsesassay vil blive brugt til at udføre genotypning for LINC00511 SNP'er (rs17780195, rs9906859 og rs1558535) ved brug af TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) og StepOnemal Cycllus, USA ).

3.5. Statistisk analyse Den statistiske analyse blev udført i R-software (version 4.2.0). Først blev genotypefrekvenser for hver undersøgt SNP kontrolleret for at være i overensstemmelse med Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) ved hjælp af Pearsons χ 2 Chi-kvadrattest.

Elevens t-test og χ2-testen blev brugt til at sammenligne kvantitative og kvalitative variabler mellem henholdsvis CRC- og kontrolgrupperne. Efter justering for demografiske faktorer (alder, køn, BMI, familiehistorie med kræft i første grads slægtninge) blev der anvendt en ubetinget logistisk regression for at udforske de uafhængige risikofaktorer for CRC blandt de undersøgte LINC00511 SNP'er ved hjælp af de co-dominante, dominante, over- dominante og recessive genotypiske modeller, der derefter sammenlignes ved hjælp af mål for modeltilpasning og forudsigelse (Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFadden's, Cox og Snell's, og Nagelkerke's)), og area-under-receiver operationskarakteristika (AUC) kurven. Den additive/co-dominante model var overlegen i forhold til alle modeller baseret på disse kriterier. Sensitivitet (SN), specificitet (SP), positiv prædiktiv værdi (PPV) og negativ forudsagt værdi (NPV) blev rapporteret for modellen med den bedste pasform og forudsigelsesevne (ikke til ren sygdomsdiagnose). De optimale cut-offs for alder, CA19-9 og CEA-kategorisering af LINC00511 SNP'er blev bestemt ved hjælp af ROC-analyse. BMI blev kategoriseret baseret på standarddefinitionerne af overvægtige og fede personer (personer med BMI ≥ 25 kg/m2 blev betragtet som overvægtige eller fede). SNPs genotyper blev analyseret ved hjælp af snpReady biblioteket i R (Granato et al., 2018) [manglende genotyper blev imputeret ved hjælp af Wrights metode (baseret på Wrights ligevægt) og manglende baseline demografiske og kliniske data blev imputeret ved hjælp af den prædiktive middel-matchningsmetode implementeret i R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Multipel logistisk regressionsanalyse blev udført for at undersøge sammenhængen mellem hver SNP-allel, genotyper, haplotyper og CRC-prævalens, stadium og grad, mens der blev justeret for basislinjekovariater (alder, BMI og yderligere risikofaktorer for tumorstadie og tumorgrad, patienter) ' cancerfamiliehistorie, tumorsted, historie med IBD), klassiske tumormarkører (CEA og CA19.9) og tilstedeværelse eller fravær af vaskulær infiltration.

Firths logistiske regression blev implementeret i tilfælde af kvasi-separation i en eller flere variable. Haploview-softwareversion 2.0 blev brugt til at beregne r2 og D', da målingerne af koblingsuligevægtsudstrækning mellem parvise SNP-kombinationsblokke af forskellige genotyper blev bestemt ved hjælp af SHEsis-softwaren http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. En stratificeret analyse og SHEsis plus online software http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html anvendt til yderligere at evaluere sammenhængen mellem LINC00511 SNP'er og CRC-følsomhed samt haplotypefrekvens, da en måling af genetisk fordeling blev direkte beregnet i CRC og raske kontrolgrupper. Yderligere blev Epistasis analyseret af Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) pakkesoftware i R https://ritchielab.org/software/mdr-download for at udføre SNP-SNP eller gen-gen og SNP-Environment eller gen-miljø interaktionsanalyse, anvendt til at evaluere den interaktive rolle af genetiske og demografiske faktorer (falsk opdagelsesrate blev kontrolleret ved at justere signifikansniveauet ved hjælp af Benjamini og Hochberg, Benjamini og Yekutieli, Holm step-down, Sidak step-down og Sidak enkelttrins p-værdijustering procedurer). Når man sammenligner modellernes forudsigelsesevne ved hjælp af pseudo-R-kvadrerede mål og SN, SP, PPV og NPV by ROC-kurven, hjælper det udover MDR-delen til LINC00511 SNPs rs forudsigelse. Forudsigelsesmetode LD-værdier blev beregnet ved en parvis estimering mellem LINC00511 SNP'er genotypet i den samme prøve og inden for et givet vindue. En etableret metode blev brugt til at estimere den maksimale sandsynlighed for andelen af, at hver mulig haplotype bidrog til den dobbelte heterozygot.

For at bekræfte, at forskelle mellem opnåede resultater i patientgruppen ikke var tilfældige, blev der anvendt en Bonferroni-beregning på dataene.

Endelig analyserede efterforskerne den samlede overlevelse (OS) i 2 år hos CRC-patienterne (n=200) med registrering af dødsdatoen eller sidste kontakt med klinikeren som det opfølgende slutpunkt. For sygdomsfri overlevelse (DFS), som hændelsen fri overlevelse (EFS), hos patienter med ikke-metastatisk CRC på diagnosetidspunktet, var datoen for tilbagefald eller sidste kontakt med klinikeren det opfølgende slutpunkt. Den ikke-parametriske Kaplan-Meier-metode (PROC LIFETEST) blev udført for OS-kurver og EFS. Overlevelsessandsynlighedsberegneren genererer Kaplan-Meier-kurven med 95 % CI, ved hjælp af log-rank test ved hjælp af Chi-kvadratfordelingen, til sammenligning af mere end to grupper.

Den relative risiko for sygdomstilbagefald blev estimeret som hazard ratio (HR). Univariable overlevelsesanalyser blev udført for køn, MBI, tumorsted, familiehistorie med cancer, lymfeknudeinvolvering, TNM-stadie og tumorgrader separat for CRC-patientgruppen såvel som for LINC00511 SNP'er genotyper.

Betydningsniveau. En tosidet værdi på P ≤ 0,05 blev anset for at være et tegn på statistisk signifikans.