Implicación de variaciones genéticas en el ARN intergénico no codificante largo 00511 (LINC00511) en el cáncer colorrectal

1. Introducción

   1.1. Fondo El cáncer colorrectal (CCR) representa el séptimo cáncer más común en Egipto. Se espera que la carga mundial del CCR aumente un 60%, para 2030, en términos de nuevos casos y muertes.

   Los tratamientos tradicionales, incluidas la radioterapia y la quimioterapia, se asocian con diversos efectos secundarios indeseables. Mientras tanto, la tasa de supervivencia a 5 años para el CCR es de ~64%, pero cae al 12% para el CCR metastásico. Por tanto, es necesario el desarrollo de marcadores de pronóstico fiables y precisos. Los ARN largos no codificantes (lncRNA) juegan un papel importante en diferentes tipos de cáncer a través de la regulación de la expresión genética, la síntesis de proteínas y son firmas epigenéticas.

   El ncRNA intergénico largo 00511 (LINC00511) es un ncRNA de 2265 pb que ejerce una función oncogénica en muchos cánceres, como el glioma, el cáncer de ovario y el CCR. Se ha descubierto que los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en los lncRNA están asociados con el cáncer. Estas variantes genéticas pueden aumentar o reducir el riesgo de cáncer según la ubicación de estos SNP. Recientemente, los SNP LINC00511 se asociaron con el riesgo de cáncer de mama (BC) en la población china y actualmente, el supervisor jefe está estudiando los SNP LINC00511 en la BC egipcia. Además, abordar la implicación de los SNP LINC00511 en el CCR, que aún no se ha estudiado, podría ser útil para comprender la patogénesis del CCR, vincular los SNP LINC00511 con la gravedad de la enfermedad, así como para descubrir nuevos objetivos para la prevención y/o el tratamiento del CCR.

   1.2. Objetivo del trabajo Investigar la asociación entre los SNP LINC00511 (rs17780195 o rs9906859 y rs1558535) y la susceptibilidad y/o patogénesis del CCR además de conocer la interacción entre estos SNP y factores clínico-patológicos como el tipo histopatológico, tamaño del tumor, metástasis a ganglios linfáticos y grado del tumor.

2. Sujetos participantes del estudio; Se clasificará en dos grupos principales.

   2.1. Casos de CCR del grupo I: se reclutaron 200 pacientes con CCR de los hospitales universitarios de Mansoura, previamente firmaron un consentimiento informado para participar en el estudio después de obtener la aprobación de la junta de revisión del comité de ética de investigación institucional (REC) requerida. El tamaño de la muestra se calculó de acuerdo con los mismos SNP estudiados. en BC en un estudio chino, según los métodos estadísticos pertinentes. Criterio de exclusión; pacientes con VHB, esquistosomiasis, VIH, consumo de alcohol, disfunción tiroidea, enfermedades inflamatorias, diabetes mellitus y trastornos cardiovasculares. Sujetos que reciben quimioterapia o radioterapia, o se han sometido a una operación quirúrgica del tracto gastrointestinal, pacientes con enfermedades de trastornos sanguíneos, cualquier cáncer distinto del CCR, pacientes con enfermedades neuronales, enfermedades respiratorias, enfermedades uterinas, enfermedades renales, cirrosis hepática, uso prolongado de corticosteroides. u hormonas sexuales. Además, pacientes con datos o diagnóstico histopatológico incompletos.

   Criterios clínico-patológicos: Los datos clínicos se obtendrán de las historias clínicas y de los informes patológicos originales. Estos datos se compilarán en un archivo excel. Los siguientes datos clínicos se registrarán y evaluarán como en el archivo Excel adjunto.

   • Se registrarán los antecedentes familiares completos de todos los participantes, -El historial de cáncer individual y la evaluación clínica del tumor realizada utilizando la clasificación de metástasis de ganglios tumorales (TNM) del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC),
   • Las características de los participantes con respecto al índice de masa corporal (IMC), marcador(es) de inflamación, recuento de plaquetas, hemograma completo y pruebas de función hepática, -tipo histopatológico de cáncer por determinar, tamaño del tumor, así como biomarcadores clínico-patológicos carcinoembrionarios. antígeno (CEA) y antígeno de carcinoma 19.9 (CA19.9), Los datos de Ki-67 o PCNA (si los hay) se recopilarán de los archivos de los pacientes para realizar correlaciones y análisis estadísticos adicionales.
   • Para el subgrupo de pacientes metastásicos (si lo hay, o si se realizará un seguimiento), el tipo de tratamiento y el sitio de destino metastásico, la supervivencia libre de enfermedad (SSE), la supervivencia general (SG), la duración de la supervivencia del paciente desde el El momento del inicio del tratamiento se considerará una medida directa universalmente aceptada del beneficio clínico.

   2.2. Grupo Control: aparentemente sano, emparejado en edad y sexo, 200 voluntarios, que no padecen ninguna enfermedad ni toman ningún medicamento. Se reclutaron sujetos de control con funciones renales y niveles de enzimas hepáticas normales, sin evidencia clínica o de laboratorio de CCR, durante exámenes de control de rutina para ellos o sus familiares o del Programa Presidencial Nacional de Detección de Enfermedades Crónicas.

3. Metodología

3.1. Acceso a bases de datos in silico:

• El Comité de Nomenclatura Genética de HUGO (HGNC), con el apoyo del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI), proporcionó un informe https://www.genenames.org/ (consultado en abril de 2022) e identificación del gen LINC00511 mediante identificación de tarjeta genética (consultado en abril de 2022). Además, la expresión del gen LINC00511 se obtuvo a partir de RNA-seq utilizando la unidad de datos TPM, de 53 muestras de tejido humano del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) de Expression Atlas. Expresión genética en todas las especies y condiciones biológicas https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (consultado el 3 de enero de 2022).
• Selección de SNP: Basado en el estudio previo de Han et al. que estudió varios SNP LINC00511 en cáncer de mama y después de realizar pruebas de detección de una frecuencia de alelo menor (MAF) superior a 0,05 = ≥ 5 %. MAF se obtuvo del Recurso Internacional de Muestras del Genoma (IGSR) que respalda datos abiertos de variación humana https://www.internationalgenome.org/ en datos de 1000 genomas https://www.ensembl.org/ 1000GENOMAS:fase_3.

Servidor web SNPinfo http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- Se accedió a bin/snpinfo/snpfunc.cgi para obtener información de SNP en la secuencia de ADN y predecir un efecto de SNP en vecinos potenciales.

3.2. Muestra de sangre de 5 ml recolectada de controles y pacientes con CCR, en vacutainers con anticoagulante EDTA y almacenada a -80º C, hasta la evaluación bioquímica en el Laboratorio de Investigación de Bioquímica Avanzada (ABRL), Facultad de Farmacia, Universidad Ain Shams (entorno de investigación).

3.3. Extracción de ADN de sangre utilizando un kit de extracción QIAmp DNA Blood Mini a partir de 200 μL de sangre total, según las instrucciones del fabricante. La cuantificación del ADN se realizó mediante NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido).

3.4. El genotipado de SNP mediante el ensayo de genotipado de SNP TaqMan® se utilizará para realizar el genotipado de los SNP LINC00511 (rs17780195, rs9906859 y rs1558535) mediante el uso de TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y el ciclador térmico StepOnePlus (Applied Biosystems, EE. UU. ).

3.5. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó en el software R (versión 4.2.0). En primer lugar, se comprobó que las frecuencias genotípicas de cada SNP estudiado estuvieran en concordancia con el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) utilizando las pruebas de χ 2 Chi-cuadrado de Pearson.

Se utilizaron la prueba t de Student y la prueba de χ2 para comparar variables cuantitativas y cualitativas entre los grupos CCR y control, respectivamente. Después de ajustar por factores demográficos (edad, sexo, IMC, antecedentes familiares de cáncer en parientes de primer grado), se aplicó una regresión logística incondicional para explorar los factores de riesgo independientes de CCR entre los SNP LINC00511 examinados utilizando el codominante, dominante, sobre- modelos genotípicos dominantes y recesivos, y luego se comparan utilizando medidas de ajuste y predicción del modelo (el Criterio de información de Akaike (AIC), el Criterio de información bayesiano (BIC), el Criterio de información de desviación (DIC), el Pseudo R2 (McFadden, Cox y Snell, y Nagelkerke)), y la curva de características operativas del área bajo el receptor (AUC). El modelo aditivo/co-dominante fue superior a todos los modelos basados ​​en estos criterios. Se informaron la sensibilidad (SN), la especificidad (SP), el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) para el modelo con mejor ajuste y poder predictivo (no para el mero diagnóstico de la enfermedad). Los puntos de corte óptimos para la categorización de edad, CA19-9 y CEA de los SNP LINC00511 se determinaron mediante análisis ROC. El IMC se clasificó según las definiciones estándar de personas con sobrepeso y obesidad (los sujetos con un IMC ≥ 25 kg/m2 se consideraron con sobrepeso u obesidad). Los genotipos de SNP se analizaron utilizando la biblioteca snpReady en R (Granato et al., 2018) [los genotipos faltantes se imputaron utilizando el método de Wright (basado en el equilibrio de Wright) y los datos demográficos y clínicos de referencia faltantes se imputaron utilizando el método de coincidencia de medias predictivas implementado en R (van Buuren y Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Se realizó un análisis de regresión logística múltiple para examinar la asociación entre cada alelo, genotipo, haplotipo y prevalencia, estadio y grado del CCR, mientras se ajustaban las covariables iniciales (edad, IMC y factores de riesgo adicionales para el estadio y el grado del tumor, pacientes). ' antecedentes familiares de cáncer, sitio del tumor, antecedentes de EII), marcadores tumorales clásicos (CEA y CA19.9) y presencia o ausencia de infiltración vascular.

Se implementó la regresión logística de Firth en el caso de cuasi-separación en una o más variables. Se utilizó el software Haploview versión 2.0 para calcular r2 y D' ya que las mediciones de la extensión del desequilibrio de ligamiento entre bloques de combinaciones de SNP por pares de diferentes genotipos se determinaron utilizando el software SHEsis http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Un análisis estratificado y el software en línea SHEsis plus http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html Se aplicó para evaluar más a fondo la asociación entre los SNP LINC00511 y la susceptibilidad al CCR, así como la frecuencia de los haplotipos, ya que una medida de la distribución genética se calculó directamente en el CCR y en los grupos de control sanos. Además, la epistasis se analizó mediante el paquete de software de reducción de dimensionalidad multifactorial (MDR) en R https://ritchielab.org/software/mdr-download para llevar a cabo análisis de interacción SNP-SNP o gen-gen y SNP-Environment o gen-ambiente. se aplicó para evaluar el papel interactivo de los factores genéticos y demográficos (la tasa de descubrimiento falso se controló ajustando el nivel de significancia utilizando Benjamini y Hochberg, Benjamini y Yekutieli, reducción de Holm, reducción de Sidak y ajuste del valor p de un solo paso de Sidak procedimientos). Al comparar la capacidad predictiva de los modelos que utilizan las medidas pseudo-R cuadrado y la curva SN, SP, PPV y NPV por ROC, además de la parte MDR, ayuda para la predicción de SNP rs LINC00511. Los valores de LD del método de predicción se calcularon mediante una estimación por pares entre los SNP LINC00511 genotipados en la misma muestra y dentro de una ventana determinada. Se utilizó un método establecido para estimar la probabilidad máxima de la proporción de que cada haplotipo posible contribuyera al doble heterocigoto.

Para confirmar que las diferencias entre los resultados obtenidos en el grupo de pacientes no fueron casuales, se aplicó un cálculo de Bonferroni a los datos.

Finalmente, los investigadores analizaron la supervivencia general (SG) durante 2 años en los pacientes con CCR (n = 200) registrando la fecha de muerte o el último contacto con el médico como criterio de valoración del seguimiento. Para la supervivencia libre de enfermedad (SSE), como supervivencia libre de eventos (SSC), en pacientes con CCR no metastásico en el momento del diagnóstico, la fecha de la recaída o el último contacto con el médico fue el criterio de valoración del seguimiento. Se utilizó el método no paramétrico de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST) para las curvas de OS y EFS. La calculadora de probabilidad de supervivencia genera la curva de Kaplan-Meier con IC del 95%, utilizando la prueba de rangos logarítmicos utilizando la distribución Chi cuadrado, para comparar más de dos grupos.

El riesgo relativo de recaída de la enfermedad se estimó como índice de riesgo (HR). Se realizaron análisis de supervivencia univariables para género, MBI, sitio del tumor, antecedentes familiares de cáncer, afectación de los ganglios linfáticos, estadio TNM y grados del tumor por separado, para el grupo de pacientes con CCR, así como para los genotipos de SNP LINC00511.

Nivel de significancia. Un valor bilateral de P ≤ 0,05 se consideró un signo de significación estadística.