Implicatie van genetische variaties in lang intergeen niet-coderend RNA 00511 (LINC00511) bij colorectale kanker

1. Invoering

   1.1. Achtergrond Colorectale kanker (CRC) is de zevende meest voorkomende vorm van kanker in Egypte. De mondiale last van colorectale kanker zal naar verwachting tegen 2030 met 60% toenemen, in termen van nieuwe gevallen en sterfgevallen.

   Traditionele behandelingen, waaronder radio- en chemotherapie, gaan gepaard met verschillende ongewenste bijwerkingen. Ondertussen is het vijfjaarsoverlevingspercentage voor CRC ~64%, maar daalt tot 12% voor gemetastaseerd CRC. Daarom is de ontwikkeling van betrouwbare en nauwkeurige prognostische markers noodzakelijk. Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) spelen een belangrijke rol bij verschillende soorten kanker door regulatie van genexpressie en eiwitsynthese, zijnde epigenetische kenmerken.

   Lang intergeen ncRNA 00511 (LINC00511) is een ncRNA van 2265 bp dat een oncogene functie uitoefent bij veel vormen van kanker, zoals glioom, eierstokkanker en dikkedarmkanker. Er is gevonden dat single nucleotide polymorphisms (SNPs) in lncRNAs geassocieerd zijn met kanker. Dergelijke genetische varianten kunnen het risico op kanker vergroten of verkleinen, afhankelijk van de locatie van deze SNP's. Onlangs werden LINC00511 SNP's geassocieerd met het risico op borstkanker in de Chinese bevolking en momenteel bestudeert de hoofdsupervisor LINC00511 SNP's in het Egyptische BC. Bovendien kan het nuttig zijn om de implicatie van LINC00511 SNP's bij CRC aan te pakken, die nog niet is onderzocht, voor het begrijpen van de pathogenese van CRC, het koppelen van LINC00511 SNP's aan de ernst van de ziekte, en voor het ontdekken van een nieuw doelwit voor de preventie en/of behandeling van CRC.

   1.2. Doel van het werk Onderzoek naar de associatie tussen LINC00511 SNPs (rs17780195 of rs9906859 en rs1558535) en CRC-gevoeligheid en/of pathogenese, naast het achterhalen van de interactie tussen deze SNPs en klinisch-pathologische factoren zoals histopathologisch type, tumorgrootte, lymfekliermetastase en tumor graad.

2. Onderwerpen Studiedeelnemers; zal worden ingedeeld in twee hoofdgroepen

   2.1. Groep I CRC-gevallen: 200 CRC-patiënten werden gerekruteerd uit de universitaire ziekenhuizen van Mansoura, die eerder een geïnformeerde toestemming hadden ondertekend om deel te nemen aan het onderzoek na het verkrijgen van de vereiste goedkeuring van de institutionele onderzoeksethische commissie (REC). De steekproefomvang werd berekend op basis van dezelfde bestudeerde SNP's in BC in een Chinese studie, volgens de relevante statistische methoden. Uitsluitingscriteria; patiënten met HBV, schistosomiasis, HIV, alcoholgebruik, schildklierdisfunctie, ontstekingsziekten, diabetes mellitus en cardiovasculaire aandoeningen. Proefpersonen die chemotherapie of radiotherapie kregen, of een operatie aan het GIT hadden ondergaan, patiënten met bloedziektes, andere vormen van kanker dan CRC, patiënten met neuronale ziekten, ademhalingsziekten, baarmoederziekten, nierziekten, levercirrose, langdurig gebruik van corticosteroïden of geslachtshormonen. Bovendien, patiënten met onvolledige gegevens of histopathologische diagnose.

   Klinisch-pathologische criteria: Klinische gegevens zullen worden verkregen uit medische dossiers en de originele pathologierapporten. Deze gegevens worden verzameld in een Excel-bestand. De volgende klinische gegevens moeten worden vastgelegd en beoordeeld zoals in bijgevoegd Excel-bestand.

   • Van alle deelnemers wordt de volledige familiegeschiedenis geregistreerd. -Individuele kankergeschiedenis en de klinische beoordeling van de tumor, uitgevoerd met behulp van de tumor-knoop-metastase (TNM) classificatie van het American Joint Committee on Cancer (AJCC),
   • De kenmerken van de deelnemers met betrekking tot body mass index (BMI), ontstekingsmarker(s), aantal bloedplaatjes, CBC en leverfunctietesten, - Histopathologisch type van kanker nog te bepalen, tumorgrootte, evenals klinisch-pathologische biomarkers carcino-embryonaal antigeen (CEA) en carcinoomantigeen 19.9 (CA19.9), Ki-67- of PCNA-gegevens (indien aanwezig) zullen worden verzameld uit patiëntendossiers voor verdere correlaties en statistische analyse,
   • Voor de subgroep van de gemetastaseerde patiënten (indien van toepassing, of als er follow-up zal plaatsvinden) het behandelingstype en de plaats van bestemming van de metastatische ziekte, ziektevrije overleving (DFS), algehele overleving (OS), de duur van de overleving van de patiënt vanaf de tijdstip waarop de behandeling wordt gestart, zal worden beschouwd als een universeel aanvaarde directe maatstaf voor het klinische voordeel.

   2.2. Controlegroep: ogenschijnlijk gezond, leeftijd en geslacht overeenkomend, 200 vrijwilligers, lijden niet aan enige ziekte en gebruiken geen medicijnen. Controlepersonen met normale nierfuncties en leverenzymspiegels, waarbij enig klinisch of laboratoriumbewijs van CRC ontbrak, werden gerekruteerd tijdens routinematige controleonderzoeken voor zichzelf of hun familieleden of uit het Chronic Diseases Screening National Presidential Program.

3. Methodologie

3.1. In silico-databases toegang:

• Het HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC), ondersteund door het National Human Genome Research Institute (NHGRI), heeft een rapport verstrekt https://www.genenames.org/ (geraadpleegd in april 2022) en identificatie van het LINC00511-gen met behulp van genkaartidentificatie (geraadpleegd in april 2022). Bovendien werd LINC00511-genexpressie verkregen uit RNA-seq met behulp van data-eenheid TPM, uit 53 menselijke weefselmonsters van het Genotype-Tissue Expression (GTEx) Project van Expression Atlas Genexpressie over soorten en biologische omstandigheden https://www.ebi. ac.uk/gxa/home (geraadpleegd op 3 januari 2022).
• SNP-selectie: Gebaseerd op de eerdere studie van Han et al. die verschillende LINC00511 SNP's bestudeerden bij borstkanker en na screening op een minor allelfrequentie (MAF) boven 0,05= ≥ 5%. MAF werd verkregen van de International Genome Sample Resource (IGSR) Ondersteuning van open menselijke variatiegegevens https://www.internationalgenome.org/ in 1000 genomengegevens https://www.ensembl.org/ 1000GENOMES:fase_3.

SNPinfo-webserver http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi- bin/snpinfo/snpfunc.cgi werd gebruikt om SNP-informatie in de DNA-sequentie te verkrijgen en om één SNP-effect op potentiële buren te voorspellen.

3.2. Bloedafname 5 ml verzameld bij controles en CRC-patiënten, op EDTA-antistollingsvacutainers en bewaard bij -80ºC, tot biochemische beoordeling in het Advanced Biochemistry Research Lab (ABRL), Faculteit der farmacie, Ain Shams University (onderzoekssetting).

3.3. DNA-extractie uit bloed met behulp van een QIAmp DNA Blood Mini-extractiekit uit 200 μl volbloed, volgens de instructies van de fabrikant. DNA-kwantificering werd uitgevoerd door NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, VK).

3.4. SNP's Genotypering met behulp van de TaqMan® SNP-genotyperingstest zal worden gebruikt om de genotypering uit te voeren voor LINC00511 SNP's (rs17780195, rs9906859 en rs1558535) met behulp van de TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, VS) en StepOnePlus Thermal Cycler (Applied Biosystems, VS). ).

3.5. Statistische analyse De statistische analyse werd uitgevoerd in R-software (versie 4.2.0). Eerst werd gecontroleerd of de genotypefrequenties voor elke bestudeerde SNP in overeenstemming waren met het Hardy-Weinberg-evenwicht (HWE) met behulp van Pearson's χ 2 Chi-kwadraattests.

De Student's t-test en de χ2-test werden gebruikt om kwantitatieve en kwalitatieve variabelen tussen respectievelijk de CRC- en controlegroepen te vergelijken. Na correctie voor demografische factoren (leeftijd, geslacht, BMI, familiegeschiedenis van kanker bij eerstegraads familieleden), werd een onvoorwaardelijke logistische regressie toegepast om de onafhankelijke risicofactoren voor colorectale borstkanker onder de onderzochte LINC00511 SNP’s te onderzoeken met behulp van de co-dominante, dominante, over- dominante en recessieve genotypische modellen, die vervolgens worden vergeleken met behulp van metingen van modelfit en voorspelling (het Akaike Information Criterion (AIC), Bayesian Information Criterion (BIC), Deviance Information Criterion (DIC), Pseudo R2 (McFadden's, Cox en Snell's, en Nagelkerke's)), en de curve van de operationele kenmerken van de oppervlakte onder de ontvanger (AUC). Het additieve/co-dominante model was superieur aan alle modellen op basis van deze criteria. Gevoeligheid (SN), specificiteit (SP), positief voorspellende waarde (PPV) en negatief voorspelde waarde (NPV) werden gerapporteerd voor het model met de beste pasvorm en voorspellende kracht (niet alleen voor ziektediagnose). De optimale grenswaarden voor leeftijd, CA19-9 en CEA-categorisatie van LINC00511 SNP's werden bepaald met behulp van ROC-analyse. De BMI werd gecategoriseerd op basis van de standaarddefinities van personen met overgewicht en obesitas (proefpersonen met een BMI ≥ 25 kg/m2 werden als overgewicht of obesitas beschouwd). SNP-genotypes werden geanalyseerd met behulp van de snpReady-bibliotheek in R (Granato et al., 2018) [ontbrekende genotypen werden geïmputeerd met behulp van de methode van Wright (gebaseerd op het evenwicht van Wright) en ontbrekende demografische en klinische basisgegevens werden geïmputeerd met behulp van de voorspellende gemiddelde matchingmethode geïmplementeerd in R (van Buuren & Groothuis-Oudshoorn, 2011)].

Er werd meerdere logistische regressieanalyse uitgevoerd om de associatie tussen alle SNP-allelen, genotypen, haplotypes en CRC-prevalentie, -stadium en -graad te onderzoeken, terwijl werd gecorrigeerd voor baseline-covariabelen (leeftijd, BMI en aanvullende risicofactoren voor tumorstadium en tumorgraad, patiënten familiegeschiedenis van kanker, tumorplaats, geschiedenis van IBD), klassieke tumormarkers (CEA en CA19.9), en de aan- of afwezigheid van vasculaire infiltratie.

De logistieke regressie van Firth werd geïmplementeerd in het geval van quasi-scheiding in een of meer variabelen. Haploview-softwareversie 2.0 werd gebruikt om r2 en D' te berekenen, aangezien de metingen van de mate van koppelingsonevenwicht tussen paarsgewijze SNP-combinatieblokken van verschillende genotypen werden bepaald met behulp van de SHEsis-software http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php. Een gestratificeerde analyse en de SHEsis plus online software http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html toegepast om de associatie tussen LINC00511 SNP's en CRC-gevoeligheid en de haplotypefrequentie verder te evalueren, aangezien een meting van de genetische distributie rechtstreeks werd berekend in CRC en gezonde controlegroepen. Verder werd Epistasis geanalyseerd door Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) pakketsoftware in R https://ritchielab.org/software/mdr-download voor het uitvoeren van SNP-SNP of gen-gen en SNP-Environment of gen-omgeving interactieanalyse, toegepast om de interactieve rol van genetische en demografische factoren te evalueren (het percentage valse ontdekkingen werd gecontroleerd door het significantieniveau aan te passen met behulp van Benjamini en Hochberg, Benjamini en Yekutieli, Holm step-down, Sidak step-down en Sidak single-step p-waarde-aanpassing procedures). Bij het vergelijken van het voorspellende vermogen van de modellen met behulp van de pseudo-R-kwadraatmetingen en de SN-, SP-, PPV- en NPV-door-ROC-curve, naast het MDR-gedeelte, wordt de rs-voorspelling van LINC00511 SNP's ondersteund. Voorspelmethode LD-waarden werden berekend door een paarsgewijze schatting tussen LINC00511 SNP's gegenotypeerd in hetzelfde monster en binnen een bepaald venster. Er werd een gevestigde methode gebruikt om de maximale waarschijnlijkheid te schatten van het aandeel dat elk mogelijk haplotype bijdroeg aan de dubbele heterozygoot.

Om te bevestigen dat de verschillen tussen de verkregen resultaten in de patiëntengroep niet toevallig waren, werd een Bonferroni-berekening op de gegevens toegepast.

Ten slotte analyseerden de onderzoekers de totale overleving (OS) gedurende 2 jaar bij de CRC-patiënten (n=200), waarbij de datum van overlijden of het laatste contact met de arts als follow-upeindpunt werd geregistreerd. Voor de ziektevrije overleving (DFS), aangezien de gebeurtenisvrije overleving (EFS), bij patiënten met niet-gemetastaseerd CRC op het moment van de diagnose, was de datum van het recidief of het laatste contact met de arts het follow-upeindpunt. De niet-parametrische Kaplan-Meier-methode (PROC LIFETEST) werd uitgevoerd voor OS-curven en EFS. De overlevingskanscalculator genereert de Kaplan-Meier-curve met 95% BI, met behulp van een log-rank-test met behulp van de Chi-kwadraatverdeling, voor vergelijking van meer dan twee groepen.

Het relatieve risico op terugval van de ziekte werd geschat als de risicoratio (HR). Univariabele overlevingsanalyses werden afzonderlijk uitgevoerd voor geslacht, MBI, tumorplaats, familiegeschiedenis van kanker, betrokkenheid van de lymfeklieren, TNM-stadium en tumorgraden, zowel voor de CRC-patiëntengroep als voor LINC00511 SNPs-genotypes.

Mate van belang. Een tweezijdige waarde van P ≤ 0,05 werd beschouwd als een teken van statistische significantie.