さまざまなタイプの肝臓ドナーにおける肝臓損傷のバイオマーカーとしてのマイクロRNAプロファイル。

2019年10月から2021年5月にかけて、スペインのバルセロナにあるバルデヘブロン大学病院で、死亡した成人の臓器提供者から灌流液、肝生検、血清サンプルが前向きに収集された。

成人脳死ドナー (n=10) および循環死後のドナー (n=10) からのサンプルを、miR-122、miR-148、miR-155、miR-22、miR-222 の存在および miR122 の比率について分析しました。 /miR222、文献から選択された肝損傷の標的バイオマーカー。

参照 miRNA プロファイルを設定するために、重大な脂肪症により移植片が使用不可能になったドナーのサブグループ (n=3) を分析しました。

生検関連の傷害を避けるために、再移植、小児移植、分割移植のドナーは除外されました。

研究期間中に生体ドナーは含まれていなかったため、待機的胆嚢摘出術を受けた健康な対照のサブグループ（n=7）からの血清検体を分析した。

この研究は博士論文の一部であり、データ収集はスペインのバルセロナにある三次病院センターの臓器提供者の空き状況に基づいて主任研究者によって行われました。 リソース制限の制約に基づいて、サンプル サイズは 2 年間に取得された連続サンプルに制限されました。

研究に参加した患者およびドナーの親族から書面によるインフォームドコンセントを得た。 患者からのサンプルとデータは、スペイン国立バイオバンク ネットワークに統合されているバル ディ ヘブロン大学病院バイオバンク (PT20/00107) から提供され、標準的な操作手順に従って処理されました。 この研究プロトコールはバルデヘブロン大学病院の医療倫理委員会によって承認されており[PR(AG)46/2019]、ヘルシンキ宣言に概説されている原則に準拠している。

統計分析:

データの品質を最適化するために、極端な Ct 値 (11 未満の Ct または 39 を超える Ct) の読み取り値は破棄されました。 分析された異なるサンプル (技術的に 3 回反復) における各 miRNA の Ct の平均と標準偏差が計算されました。 分析データの品質を向上させるために、標準偏差が高い (Ct SD が 0.3 を超える) 3 回の実験では、平均から最も遠い Ct 値が削除され、サンプルごとの miRNA ごとに合計少なくとも 2 つの値が残されました。 同様に、各 miRNA について、有効な複製が 2 つ未満のサンプルは除外されました。 潜在的な RNA インプットまたは RT 効率のバイアスを補正するために、内因性参照 (miR-103a、miR-191、miR-30c、miR-16、および let7a) の平均 Ct を使用して Ct 値を正規化しました。 miRNA 相対定量 (RQ) レベルは、Livak et al.方法 2^(-ΔΔCt)、ΔCt (miRNA Ct ターゲット - 平均内在性コントロール Ct) および比較グループ間の差 (ΔΔCt) (ΔCt 比較 - ΔCt 参照サンプル) として計算されます。 グループ比較は、連続データの場合は T 検定または U-Mann Whitney (ノンパラメトリック)、定性的なデータの場合はフィッシャー検定を使用して実行されました。 0.05 未満の P 値は有意であるとみなされました。

方法論のサブスタディ:

成人脳死ドナー (n=4) および循環死後のドナー (n=4) のサブグループを、miR-122 および miR-148 の存在について分析しました。 ヘパリンは RNA qPCR 分析において阻害効果があることが知られており、臓器採取時の血栓形成を避けるためにヘパリンが使用されるため、肝臓ドナーサンプルにはヘパリンの痕跡が残る傾向があります。 ヘパリナーゼ-I は、ヘパリン阻害効果を克服するために文献で使用されています。

このサブスタディでは、RT-qPCR による miRNA 検出レベルに対するヘパリナーゼ I の相殺効果を評価するために、サンプルを 0 IU、6 IU または 12 IU のヘパリナーゼ IU で処理しました。