Profil mikroRNA jako biomarker poškození jater u různých typů dárců jater.

Mezi říjnem 2019 a květnem 2021 byly prospektivně odebrány perfuzáty, jaterní biopsie a vzorky séra od dospělých zemřelých dárců orgánů ve Vall d'Hebron University Hospital, Barcelona, ​​Španělsko.

Vzorky od dospělých dárců lidské mozkové smrti (n=10) a dárců po oběhové smrti (n=10) byly analyzovány na přítomnost miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 a poměru miR122. /miR222, cílové biomarkery poškození jater vybrané z literatury.

Pro nastavení referenčních profilů miRNA byla analyzována podskupina dárců s nepoužitelnými štěpy v důsledku významné steatózy (n=3).

Dárci pro retransplantaci, dětští pacienti a rozdělení byli vyloučeni, aby se zabránilo poranění souvisejícím s biopsií.

Vzhledem k tomu, že ve sledovaném období nebyl žádný živý dárce, byly analyzovány vzorky séra z podskupiny zdravých kontrol podstupujících elektivní cholecystektomii (n=7).

Tato studie je součástí disertační práce a sběr dat provedl hlavní výzkumný pracovník na základě dostupnosti dárců orgánů v jednom terciárním nemocničním centru v Barceloně ve Španělsku. Na základě omezení zdrojů byla velikost vzorku omezena na po sobě jdoucí vzorky získané během 2 let.

Od pacientů a příbuzných dárců zahrnutých do studie byl získán písemný informovaný souhlas. Vzorky a data od pacientů poskytla Biobanka univerzitní nemocnice Vall d'Hebron (PT20/00107), integrovaná do španělské sítě národních biobank, a byly zpracovány podle standardních operačních postupů. Protokol studie byl schválen lékařskou etickou komisí Univerzitní nemocnice Vall d'Hebron [PR(AG)46/2019] a je v souladu s principy nastíněnými v Helsinské deklaraci.

Statistická analýza:

Pro optimalizaci kvality dat byly odečty s extrémními hodnotami Ct (Ct menší než 11 nebo Ct větší než 39) vyřazeny. Byl vypočten průměr Cts a standardní odchylka pro každou z miRNA v různých analyzovaných vzorcích (technické triplikáty). Pro zlepšení kvality analyzovaných dat byla v triplikátech s vysokou směrodatnou odchylkou (Ct SD větší než 0,3) eliminována hodnota Ct nejvzdálenější od průměru, takže celkem zůstaly alespoň dvě hodnoty na miRNA na vzorek. Podobně byly pro každou miRNA vyloučeny vzorky s méně než dvěma platnými replikáty. Pro korekci potenciálního zkreslení vstupu RNA nebo účinnosti RT byly hodnoty Ct normalizovány pomocí průměrného Ct endogenních referencí (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 a let7a). Hladiny relativní kvantifikace miRNA (RQ) byly analyzovány pomocí Livak et al. metoda 2^(-ΔACt), vypočtená následovně ΔCt (cíl miRNA Ct - zprůměrovaná endogenní kontrola Ct) a rozdíl (AACt) mezi srovnávacími skupinami (srovnání ACt - referenční vzorek ACt. Skupinová srovnání byla provedena pomocí T-testu nebo U-Mann Whitneyho (neparametrický) pro kontinuální data a Fisherova testu pro kvalitativní. P-hodnoty menší než 0,05 byly považovány za významné.

Podstudie metodiky:

Podskupina dospělých dárců lidské mozkové smrti (n=4) a dárců po oběhové smrti (n=4) byla analyzována na přítomnost miR-122 a miR-148. Je známo, že heparin má inhibiční účinek při analýze RNA qPCR a vzorky dárců jater jsou náchylné na stopy heparinu, protože se používá k zamezení tvorby trombu během odběru orgánů. Heparináza-I se v literatuře používá k překonání inhibičního účinku heparinu.

V této podstudii byly vzorky ošetřeny 0 IU, 6 IU nebo 12 IU heparinázy-I, aby se vyhodnotil protipůsobící účinek heparinázy I na hladiny detekce miRNA pomocí RT-qPCR.