Perfil de microARN como biomarcador de daño hepático en diferentes tipos de donantes de hígado.

Entre octubre de 2019 y mayo de 2021, se recogieron prospectivamente perfusiones, biopsias hepáticas y muestras de suero de donantes de órganos adultos fallecidos en el Hospital Universitario Vall d'Hebron, Barcelona, ​​España.

Se analizaron muestras de donantes adultos con muerte cerebral humana (n = 10) y donantes después de muerte circulatoria (n = 10) para determinar la presencia de miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 y la proporción de miR122. /miR222, biomarcadores objetivo de lesión hepática seleccionados de la literatura.

Para establecer los perfiles de miARN de referencia, se analizó un subgrupo de donantes con injertos inutilizables debido a esteatosis significativa (n = 3).

Se excluyeron los donantes para retrasplante, pediátricos y divididos para evitar lesiones relacionadas con la biopsia.

Como no hubo inclusiones de donantes vivos en el período de estudio, se analizaron muestras de suero de un subgrupo de controles sanos sometidos a colecistectomía electiva (n = 7).

Este estudio es parte de una tesis doctoral y la recopilación de datos fue realizada por el investigador principal basándose en la disponibilidad de donantes de órganos en un centro hospitalario de tercer nivel en Barcelona, ​​España. Debido a las limitaciones de recursos, el tamaño de la muestra se limitó a las muestras consecutivas obtenidas en un período de 2 años.

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y familiares de los donantes incluidos en el estudio. Las muestras y los datos de los pacientes fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Vall d'Hebron (PT20/00107), integrado en la Red Nacional de Biobancos de España, y se procesaron siguiendo procedimientos operativos estándar. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética médica del Hospital Universitario Vall d'Hebron [PR(AG)46/2019] y se ajusta a los principios marcados en la Declaración de Helsinki.

Análisis estadístico:

Para optimizar la calidad de los datos, se descartaron las lecturas con valores extremos de Ct (Ct menor que 11 o Ct mayor que 39). Se calculó la media de los Cts y la desviación estándar para cada uno de los miRNAs en las diferentes muestras analizadas (por triplicado técnico). Para mejorar la calidad de los datos analizados, por triplicado con desviación estándar alta (Ct SD mayor que 0,3), se eliminó el valor de Ct más alejado de la media, dejando un total de al menos dos valores por miARN por muestra. Asimismo, para cada miARN se excluyeron las muestras con menos de dos réplicas válidas. Para corregir posibles sesgos de entrada de ARN o eficiencia de RT, los valores de Ct se normalizaron utilizando el Ct promedio de referencias endógenas (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 y let7a). Los niveles de cuantificación relativa (RQ) de miARN se analizaron utilizando el método de Livak et al. método 2^(-ΔΔCt), calculado de la siguiente manera ΔCt (objetivo de Ct de miARN - Ct de control endógeno promediado) y la diferencia (ΔΔCt) entre los grupos de comparación (comparación de ΔCt - muestra de referencia de ΔCt. Las comparaciones de grupos se realizaron mediante la prueba T o U-Mann Whitney (no paramétrica) para datos continuos y la prueba de Fisher para datos cualitativos. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Subestudio de metodología:

Se analizó la presencia de miR-122 y miR-148 en un subgrupo de donantes adultos con muerte cerebral humana (n = 4) y donantes después de muerte circulatoria (n = 4). Se sabe que la heparina tiene un efecto inhibidor en el análisis de qPCR de ARN y las muestras de donantes de hígado son propensas a tener rastros de heparina, ya que se utiliza para evitar la formación de trombos durante la obtención de órganos. La heparinasa-I se ha utilizado en la literatura para superar el efecto inhibidor de la heparina.

En este subestudio, las muestras se trataron con 0 UI, 6 UI o 12 UI de heparinasa I para evaluar el efecto contrarrestante de la heparinasa I en los niveles de detección de miARN mediante RT-qPCR.