MicroRNA-profiel als biomarker voor leverschade bij verschillende soorten leverdonoren.

Tussen oktober 2019 en mei 2021 werden prospectief perfusaten, leverbiopten en serummonsters verzameld van volwassen overleden orgaandonoren in het Universitair Ziekenhuis Vall d'Hebron, Barcelona, ​​Spanje.

Monsters van volwassen menselijke hersendooddonoren (n=10) en donoren na circulatoire dood (n=10) werden geanalyseerd op de aanwezigheid van miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 en de verhouding miR122. /miR222, doelbiomarkers voor leverschade geselecteerd uit de literatuur.

Om de referentie-miRNA-profielen vast te stellen, werd een subgroep van donoren met onbruikbare transplantaten als gevolg van significante steatosis (n = 3) geanalyseerd.

Donoren voor hertransplantatie, pediatrisch en gesplitst werden uitgesloten om biopsiegerelateerd letsel te voorkomen.

Omdat er tijdens de onderzoeksperiode geen levende donoren waren opgenomen, werden serumspecimens geanalyseerd van een subgroep van gezonde controles die een electieve cholecystectomie ondergingen (n=7).

Deze studie maakt deel uit van een proefschrift en de gegevensverzameling werd uitgevoerd door de hoofdonderzoeker, gebaseerd op de beschikbaarheid van orgaandonoren in een tertiair ziekenhuiscentrum in Barcelona, ​​Spanje. Op basis van de beperkte middelen werd de steekproefomvang beperkt tot de opeenvolgende monsters die in een periode van twee jaar werden verkregen.

Er werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van patiënten en familieleden van donoren die aan het onderzoek deelnamen. Monsters en gegevens van patiënten werden aangeleverd door de Biobank van het Universitair Ziekenhuis Vall d'Hebron (PT20/00107), geïntegreerd in het Spaanse Nationale Biobankennetwerk, en werden verwerkt volgens standaardprocedures. Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de medisch-ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Vall d'Hebron [PR(AG)46/2019] en voldoet aan de principes die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki.

Statistische analyse:

Om de kwaliteit van de gegevens te optimaliseren, werden metingen met extreme Ct-waarden (Ct kleiner dan 11 of Ct groter dan 39) weggegooid. Het gemiddelde van de Cts en de standaardafwijking voor elk van de miRNA's in de verschillende geanalyseerde monsters (technische triplo's) werden berekend. Om de kwaliteit van de geanalyseerde gegevens te verbeteren, werd in triplo met hoge standaarddeviatie (Ct SD groter dan 0,3) de Ct-waarde die het verst van het gemiddelde lag geëlimineerd, waardoor er in totaal ten minste twee waarden per miRNA per monster overbleven. Op dezelfde manier werden voor elk miRNA monsters met minder dan twee geldige replicaties uitgesloten. Om te corrigeren voor mogelijke vooroordelen over RNA-invoer of RT-efficiëntie, werden de Ct-waarden genormaliseerd met behulp van de gemiddelde Ct van endogene referenties (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 en let7a). miRNA relatieve kwantificatie (RQ) niveaus werden geanalyseerd met behulp van Livak et al. methode 2^(-ΔΔCt), als volgt berekend ΔCt (miRNA Ct-doelwit - gemiddelde endogene controle-Ct) en het verschil (ΔΔCt) tussen vergelijkingsgroepen (ΔCt-vergelijking - ΔCt-referentiemonster. Groepsvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de T-test of U-Mann Whitney (niet-parametrisch) voor continue gegevens en de Fisher-test voor kwalitatieve. P-waarden kleiner dan 0,05 werden als significant beschouwd.

Methodologie deelonderzoek:

Een subgroep van volwassen menselijke hersendooddonoren (n=4) en donoren na bloedsomloopdood (n=4) werd geanalyseerd op de aanwezigheid van miR-122 en miR-148. Het is bekend dat heparine een remmend effect heeft bij RNA qPCR-analyse en leverdonormonsters zijn gevoelig voor heparinesporen, omdat het wordt gebruikt om trombusvorming tijdens orgaanverkrijging te voorkomen. Heparinase-I is in de literatuur gebruikt om het heparineremmende effect te ondervangen.

In deze substudie werden de monsters behandeld met 0 IE, 6 IE of 12 IE heparinase-I om het tegenwerkende effect van heparinase I op miRNA-detectieniveaus door RT-qPCR te evalueren.