Perfil de microRNA como biomarcador de danos hepáticos em diferentes tipos de doadores de fígado.

Entre outubro de 2019 e maio de 2021, perfusatos, biópsias hepáticas e amostras de soro foram coletadas prospectivamente de doadores adultos de órgãos falecidos no Hospital Universitário Vall d'Hebron, Barcelona, ​​Espanha.

Amostras de doadores humanos adultos em morte encefálica (n=10) e doadores após morte circulatória (n=10) foram analisadas quanto à presença de miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 e razão miR122 /miR222, biomarcadores alvo de lesão hepática selecionados na literatura.

Para definir os perfis de miRNA de referência, foi analisado um subgrupo de doadores com enxertos inutilizáveis ​​devido a esteatose significativa (n = 3).

Doadores para retransplante, pediátricos e divididos foram excluídos para evitar lesões relacionadas à biópsia.

Como não houve inclusão de doadores vivos no período do estudo, foram analisadas amostras de soro de um subgrupo de controles saudáveis ​​submetidos à colecistectomia eletiva (n=7).

Este estudo faz parte de uma tese de doutoramento e a recolha de dados foi realizada pelo investigador principal com base na disponibilidade de dadores de órgãos num centro hospitalar terciário em Barcelona, ​​Espanha. Com base em restrições de limitação de recursos, o tamanho da amostra foi limitado às amostras consecutivas obtidas num período de 2 anos.

O consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes e familiares dos doadores incluídos no estudo. As amostras e os dados dos pacientes foram fornecidos pelo Biobanco do Hospital Universitário Vall d'Hebron (PT20/00107), integrado na Rede Nacional Espanhola de Biobancos, e foram processados ​​seguindo procedimentos operacionais padrão. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética médica do Hospital Universitário Vall d'Hebron [PR(AG)46/2019] e está em conformidade com os princípios delineados na Declaração de Helsinque.

Análise estatística:

Para otimizar a qualidade dos dados, foram descartadas leituras com valores extremos de Ct (Ct menor que 11 ou Ct maior que 39). Foram calculadas a média dos Cts e o desvio padrão para cada um dos miRNAs nas diferentes amostras analisadas (triplicatas técnicas). Para melhorar a qualidade dos dados analisados, em triplicatas com desvio padrão elevado (Ct SD maior que 0,3), o valor de Ct mais distante da média foi eliminado, deixando um total de pelo menos dois valores por miRNA por amostra. Da mesma forma, para cada miRNA, foram excluídas amostras com menos de duas réplicas válidas. Para corrigir possíveis vieses de entrada de RNA ou eficiência de RT, os valores de Ct foram normalizados usando o Ct médio de referências endógenas (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 e let7a). Os níveis de quantificação relativa (RQ) de miRNA foram analisados ​​usando Livak et al. método 2^(-ΔΔCt), calculado como segue ΔCt (alvo de miRNA Ct - Ct de controle endógeno médio) e a diferença (ΔΔCt) entre grupos de comparação (comparação de ΔCt - amostra de referência ΔCt. As comparações entre os grupos foram realizadas utilizando teste T ou U-Mann Whitney (não paramétrico) para dados contínuos e teste de Fisher para qualitativos. Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Subestudo de metodologia:

Um subgrupo de doadores de morte encefálica humana adulta (n = 4) e doadores após morte circulatória (n = 4) foram analisados ​​quanto à presença de miR-122 e miR-148. Sabe-se que a heparina tem um efeito inibidor na análise qPCR de RNA e as amostras de doadores de fígado são propensas a apresentar vestígios de heparina, pois é usada para evitar a formação de trombos durante a coleta de órgãos. A heparinase-I tem sido utilizada na literatura para superar o efeito inibidor da heparina.

Neste subestudo, as amostras foram tratadas com 0 UI, 6 UI ou 12 UI de heparinase-I para avaliar o efeito neutralizante da heparinase I nos níveis de detecção de miRNA por RT-qPCR.