MicroRNA-profil som en biomarkør for leverskader hos forskellige typer leverdonorer.

Mellem oktober 2019 og maj 2021 blev perfusater, leverbiopsier og serumprøver indsamlet prospektivt fra voksne afdøde organdonorer på Vall d'Hebron Universitetshospital, Barcelona, ​​Spanien.

Prøver fra voksne menneskelige hjernedødsdonorer (n=10) og donorer efter kredsløbsdød (n=10) blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 og ratio miR122 /miR222, målbiomarkører for leverskade udvalgt fra litteraturen.

For at indstille reference miRNA-profilerne blev en undergruppe af donorer med ubrugelige transplantater på grund af signifikant steatose (n=3) analyseret.

Donorer til retransplantation, pædiatrisk og spaltning blev udelukket for at undgå biopsi-relateret skade.

Da der ikke var nogen levende donor-inklusioner i undersøgelsesperioden, blev serumprøver fra en undergruppe af raske kontroller, der gennemgår elektiv kolecystektomi (n=7), analyseret.

Denne undersøgelse er en del af en ph.d.-afhandling, og dataindsamlingen blev udført af hovedforskeren baseret på tilgængelighed af organdonorer i et tertiært hospitalscenter i Barcelona, ​​Spanien. Baseret på ressourcebegrænsninger var stikprøvestørrelsen begrænset til de på hinanden følgende prøver opnået i en 2-årig periode.

Skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra patienter og pårørende til donorer inkluderet i undersøgelsen. Prøver og data fra patienter blev leveret af Vall d'Hebron University Hospital Biobank (PT20/00107), integreret i det spanske nationale biobanknetværk, og de blev behandlet efter standard operationsprocedurer. Studieprotokollen blev godkendt af den medicinske etiske komité på Vall d'Hebron Universitetshospital [PR(AG)46/2019] og er i overensstemmelse med principperne skitseret i Helsinki-erklæringen.

Statistisk analyse:

For at optimere kvaliteten af ​​data blev aflæsninger med ekstreme Ct-værdier (Ct mindre end 11 eller Ct større end 39) kasseret. Gennemsnittet af Ct'erne og standardafvigelsen for hver af miRNA'erne i de forskellige analyserede prøver (tekniske triplikater) blev beregnet. For at forbedre kvaliteten af ​​de analyserede data, i triplikater med høj standardafvigelse (Ct SD større end 0,3), blev Ct-værdien længst fra middelværdien elimineret, hvilket efterlod i alt mindst to værdier pr. miRNA pr. prøve. Ligeledes blev prøver med mindre end to gyldige replikater udelukket for hver miRNA. For at korrigere for potentielle RNA-input eller RT-effektivitetsbias blev Ct-værdier normaliseret ved hjælp af den gennemsnitlige Ct af endogene referencer (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 og let7a). miRNA relative kvantificeringsniveauer (RQ) blev analyseret ved hjælp af Livak et al. metode 2^(-ΔΔCt), beregnet som følger ΔCt (miRNA Ct-mål - gennemsnitlig endogen kontrol-Ct) og forskellen (ΔΔCt) mellem sammenligningsgrupper (ΔCt-sammenligning - ΔCt-referenceprøve. Gruppesammenligninger blev udført ved hjælp af T-test eller U-Mann Whitney (ikke-parametrisk) for kontinuerlige data og Fisher-test for kvalitativ. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Metodisk delstudie:

En undergruppe af voksne menneskelige hjernedødsdonorer (n=4) og donorer efter kredsløbsdød (n=4) blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​miR-122 og miR-148. Heparin er kendt for at have en hæmmende effekt i RNA qPCR-analyse, og leverdonorprøver er tilbøjelige til at have heparinspor, da det bruges til at undgå trombedannelse under organudtagning. Heparinase-I er blevet anvendt i litteraturen til at overvinde den heparinhæmmende virkning.

I denne delundersøgelse blev prøverne behandlet med 0 IE, 6 IE eller 12 IE heparinase-I for at evaluere den modvirkende virkning af heparinase I på miRNA-detektionsniveauer ved RT-qPCR.