MicroRNA-profil som en biomarkør for leverskade hos forskjellige typer leverdonorer.

Mellom oktober 2019 og mai 2021 ble perfusater, leverbiopsier og serumprøver samlet inn prospektivt fra voksne avdøde organdonorer på Vall d'Hebron universitetssykehus, Barcelona, ​​Spania.

Prøver fra voksne menneskelige hjernedødsgivere (n=10) og donorer etter sirkulasjonsdød (n=10) ble analysert for tilstedeværelse av miR-122, miR-148, miR-155, miR-22, miR-222 og ratio miR122 /miR222, målbiomarkører for leverskade valgt fra litteraturen.

For å sette referanse miRNA-profilene ble en undergruppe av donorer med ubrukelige transplantater på grunn av signifikant steatose (n=3) analysert.

Donorer for retransplantasjon, pediatrisk og splittelse ble ekskludert for å unngå biopsirelatert skade.

Siden det ikke var noen levende donorinkluderinger i studieperioden, ble serumprøver fra en undergruppe av friske kontroller som gjennomgikk elektiv kolecystektomi (n=7) analysert.

Denne studien er en del av en doktorgradsavhandling og datainnsamlingen ble utført av hovedetterforskeren basert på tilgjengelighet av organdonorer i et tertiært sykehussenter i Barcelona, ​​Spania. Basert på ressursbegrensninger, ble utvalgsstørrelsen begrenset til de påfølgende prøvene som ble oppnådd i en 2-årsperiode.

Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter og pårørende til donorer inkludert i studien. Prøver og data fra pasienter ble levert av Vall d'Hebron University Hospital Biobank (PT20/00107), integrert i det spanske nasjonale biobanknettverket, og de ble behandlet etter standard operasjonsprosedyrer. Studieprotokollen ble godkjent av den medisinske etiske komiteen ved Vall d'Hebron universitetssykehus [PR(AG)46/2019] og er i samsvar med prinsippene skissert i Helsinki-erklæringen.

Statistisk analyse:

For å optimalisere kvaliteten på data ble avlesninger med ekstreme Ct-verdier (Ct mindre enn 11 eller Ct større enn 39) forkastet. Gjennomsnittet av Cts og standardavviket for hver av miRNAene i de forskjellige analyserte prøvene (tekniske triplikater) ble beregnet. For å forbedre kvaliteten på dataene som ble analysert, i triplikater med høyt standardavvik (Ct SD større enn 0,3), ble Ct-verdien lengst fra gjennomsnittet eliminert, og etterlot totalt minst to verdier per miRNA per prøve. På samme måte ble prøver med mindre enn to gyldige replikater ekskludert for hver miRNA. For å korrigere for potensielle RNA-input eller RT-effektivitetsskjevheter, ble Ct-verdier normalisert ved å bruke gjennomsnittlig Ct for endogene referanser (miR-103a, miR-191, miR-30c, miR-16 og let7a). miRNA relative kvantifiseringsnivåer (RQ) ble analysert ved å bruke Livak et al. metode 2^(-ΔΔCt), beregnet som følger ΔCt (miRNA Ct mål - gjennomsnittlig endogen kontroll Ct) og forskjellen (ΔΔCt) mellom sammenligningsgrupper (ΔCt sammenligning - ΔCt referanseprøve. Gruppesammenligninger ble utført ved bruk av T-test eller U-Mann Whitney (ikke-parametrisk) for kontinuerlige data og Fisher-test for kvalitativ. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som signifikante.

Metodedelstudie:

En undergruppe av voksne menneskelige hjernedødsgivere (n=4) og donorer etter sirkulasjonsdød (n=4) ble analysert for tilstedeværelsen av miR-122 og miR-148. Heparin er kjent for å ha en hemmende effekt i RNA qPCR-analyse, og leverdonorprøver er tilbøyelige til å ha heparinspor, da det brukes for å unngå trombedannelse under organanskaffelse. Heparinase-I har blitt brukt i litteraturen for å overvinne den heparinhemmende effekten.

I denne delstudien ble prøvene behandlet med 0 IE, 6 IE eller 12 IE heparinase-I for å evaluere den motvirkende effekten av heparinase I på miRNA-deteksjonsnivåer ved RT-qPCR.