Профиль микроРНК как биомаркер поражения печени у различных типов доноров печени.

В период с октября 2019 года по май 2021 года перфузаты, биоптаты печени и образцы сыворотки были проспективно собраны у взрослых умерших доноров органов в университетской больнице Валь д'Эброн, Барселона, Испания.

Образцы от взрослых доноров со смертью мозга (n=10) и доноров после сердечно-сосудистой смерти (n=10) были проанализированы на наличие миР-122, миР-148, миР-155, миР-22, миР-222 и соотношение миР122. /miR222, целевые биомаркеры повреждения печени, выбранные из литературы.

Чтобы установить эталонные профили микроРНК, была проанализирована подгруппа доноров с непригодными для использования трансплантатами из-за значительного стеатоза (n = 3).

Доноры для повторной трансплантации, педиатрические исследования и сплит были исключены, чтобы избежать травм, связанных с биопсией.

Поскольку в период исследования не было включений живых доноров, были проанализированы образцы сыворотки от подгруппы здоровых людей, перенесших плановую холецистэктомию (n = 7).

Это исследование является частью докторской диссертации, и сбор данных проводился главным исследователем на основе наличия доноров органов в одном из центров третичной больницы в Барселоне, Испания. Из-за ограничений ресурсов размер выборки был ограничен последовательными выборками, полученными в течение двухлетнего периода.

Письменное информированное согласие было получено от пациентов и родственников доноров, включенных в исследование. Образцы и данные пациентов были предоставлены Биобанком университетской больницы Валь д'Эброн (PT20/00107), интегрированным в Национальную сеть биобанков Испании, и обработаны в соответствии со стандартными операционными процедурами. Протокол исследования был одобрен комитетом по медицинской этике университетской больницы Валь д'Эброн [PR(AG)46/2019] и соответствует принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.

Статистический анализ:

Для оптимизации качества данных показания с крайними значениями Ct (Ct менее 11 или Ct более 39) были отброшены. Рассчитывали среднее значение Cts и стандартное отклонение для каждой микроРНК в различных проанализированных образцах (технические тройки). Чтобы улучшить качество проанализированных данных, в трех экземплярах с высоким стандартным отклонением (Ct SD более 0,3) значение Ct, наиболее удаленное от среднего, было исключено, оставив в общей сложности по крайней мере два значения на микроРНК на образец. Аналогично, для каждой микроРНК были исключены образцы с менее чем двумя действительными репликами. Чтобы скорректировать возможные отклонения от ввода РНК или эффективности RT, значения Ct были нормализованы с использованием среднего значения Ct эндогенных эталонов (миР-103a, миР-191, миР-30c, миР-16 и let7a). Уровни относительного количественного определения (RQ) микроРНК анализировали с использованием Livak et al. метод 2^(-ΔΔCt), рассчитанный следующим образом: ΔCt (мишень Ct миРНК - усредненный эндогенный контрольный Ct) и разница (ΔΔCt) между группами сравнения (ΔCt сравнения - ΔCt эталонный образец. Групповые сравнения проводились с использованием Т-критерия или U-критерия Манна Уитни (непараметрического) для непрерывных данных и критерия Фишера для качественных. Значения P менее 0,05 считались значимыми.

Методическое подразделение:

Подгруппу взрослых доноров со смертью мозга (n=4) и доноров после сердечно-сосудистой смерти (n=4) анализировали на наличие миР-122 и миР-148. Известно, что гепарин оказывает ингибирующее действие на анализ РНК с помощью qPCR, а образцы донорской печени склонны содержать следы гепарина, поскольку он используется для предотвращения образования тромбов во время забора органов. В литературе гепариназа-I использовалась для преодоления ингибирующего эффекта гепарина.

В этом подисследовании образцы обрабатывали 0 МЕ, 6 МЕ или 12 МЕ гепариназы-I для оценки противодействующего эффекта гепариназы I на уровни обнаружения микроРНК с помощью RT-qPCR.