ブルキナファソの学童におけるレチノール同位体希釈技術の検証と簡素化 (RID_VAB)

プロジェクト名 ブルキナファソの学童におけるレチノール同位体希釈技術の検証と簡素化

I. 背景と合理的 ゴールドスタンダード、つまり肝生検を反映するビタミン A ステータスのバイオマーカーは利用可能ですが、集団ベースのアプリケーションでの利用しやすさを高めるための改良が行われています。 レチノール同位体希釈 (RID) 検査は、そのようなバイオマーカーの 1 つです。 ブルキナファソでは、予測式に補正係数を加えるだけで、7 日間のテストを 14 日間のテストで評価することができました。 全身のビタミン A 貯蔵量の値は同様でしたが、肝臓の貯蔵量が増加するにつれて変動も増加しました。 学齢期の小児の肝臓重量として体重の 3% を仮定することは、肝臓の総ビタミン A 貯蔵量の計算において適切であることが確認されました。 人口評価のための同位体希釈の簡素化と質量分析分析の能力構築は、公衆衛生プログラムに情報を提供するための栄養開発の重要な分野です。 この提案は、広く使用できるように引き続き方法を改良する予定です。

II. 全体的な目的 ビタミン A の欠乏状態から過剰状態までを評価するために、大規模な集団調査でレチノール同位体希釈技術を使用する方法に関する新しい知識を提供すること。

II.1. 具体的な目標 この CRP については、いくつかの具体的な目標が概説されています。 ブルキナファソで行われる調査と既存のデータセットを通じて、私たちは学童における以下の特定の目標に焦点を当てます。

1. RID 検査を行った学童の空腹時血清レチニルエステルデータを適用して、ビタミン A 過剰総肝臓予備能値を定義する。 2. 現場でのレチノール精製技術を使用して、精度を損なうことなく既存の方法を人口調査に合わせて簡素化する方法を検討する。 3. アフリカの未就学児を対象とした既存のデータセットを使用して、レチノール同位体希釈技術が投与時の炎症によってどのような影響を受けるかを調査する。 4. レチノール同位体の吸収の違いを調べる。酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルを油から製造し、カプセル化した形で学齢期の子供に摂取させます。

Ⅲ．方法 III.1. 研究場所と人口 提案された研究は、ブルキナファソ西部のボボ・ディウラッソの外縁にある村、オロダラにある小学校で実施され、7歳から12歳の児童が対象となります。 村の住民のほとんどは中所得の農民とその家族です。 ブルキナファソは、コンソーシアム VITAAFRO (アフリカのビタミン A) に参加している国の 1 つであり、VA ステータスを正確に判断して既存の介入や政策を知らせることに関心を持っています。

III.2. 研究計画 1 学年度中に 2 つの連続した横断的研究が実施されます。 最初の研究は学年度の初めで、たまたま雨季の終わりで、マンゴーの季節も外れていました。そして 2 番目の研究は、最初のデータ収集の 5 ～ 6 か月後でした。マンゴーの季節には、これらの研究はブルキナファソ西部、ボボ・ディウラッソの外縁にある村、オロダラにある小学校で実施される。

III.3. サンプリング方法 合計 158 人の学童が 2 つの異なる方法で募集されます。 初回は、小学校の 1 年生から最終学年までの児童を含む層別サンプリングを通じて、クラスごとの人数に比例した 60 人の学童のグループが募集されます。 この最初のグループの学童 60 人には、全身貯蔵量を評価するためのレチノール同位体希釈 (RID) 検査が適用され、その値をベースラインの空腹時血清レチニルエステル濃度と比較します。

残りの 98 人の学童は、層別サンプリングに従ってクラスごとの人数に比例して採用され、性別に応じて 49 人の児童からなる 2 つのグループに分けられます。 女性49名、男性49名）。 各参加者において、2 つの時点で採血が実行されます。 参加者は、以下に指定されているように、H0、H2、H3、H4、H5、H6、H8、H10、H24、H72、H168、および H336 に採血を受けるようにランダムに割り当てられます。 ランダム化リストは、乱数のテーブルを使用して生成されます。 単純なランダム化ではなくブロック化を行うことを選択したのは、前者のアプローチにより、試験全体を通じてほぼ同じサイズになる不偏な比較グループを得ることができるためです。 ブロックのランダム化を使用すると、各研究グループの子供の数が常にほぼ同じになります。

これらの小児グループに対しては、ビタミン A 状態の定性的尺度である修正相対用量反応 (MRDR) 検査を使用して、酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルの吸収を調査します。

H0 (5)、H2 (5)、H3 (5)、H4 (11)、H5 (11) H6 (11) H8 (10)、H10 (10)、H24 (5)、H72 (5)、H168 ( 10)、H336 (10)

III.4. 地域社会の意識向上と啓発 研究を開始する前に、意識を高め、地域社会を研究に動員する取り組みの一環として、研究地域の主要な意思決定者および地域社会のリーダーと一連の会議を実施します。 これらの地域社会への啓発および啓発会議は、研究の存在と目的、さらには地域社会だけでなく国やアフリカ全体にとっての利益について地域社会に知らせます。 それぞれの人体研究の領域を選択した理由と提案されたデザインについて説明します。

III.5. 採用と選考

選考プロセスとして、対象となる児童のリストが作成され、そこから選考が行われます。 お子様は、以下の審査基準を満たしている場合に参加資格があります。

III.5.1.包含基準:

• 7～12歳の学童
• 子供の保護者または親がインフォームドコンセントを提供することに前向きである
• 子供の家族は調査期間中調査地域に居住し続ける予定である

III.5.2.除外基準:

• ビタミン A 欠乏症の臨床的証拠 形式的: Anglais (Royaume-Uni)a 形式的: Anglais (États-Unis)a 形式的: Anglais (États-Unis)a 形式的: Anglais (États-Unis)
• 重度の栄養失調（年齢別体重 Z スコア（WAZ）または年齢別身長 Z スコア（HAZ）<-3 SD）
• 結核、症候性HIV感染症などの重篤な病気
• 6 歳未満または 12 歳以上の小児 III.6. 研究変数 適格性のスクリーニング後、子供とその養育者または親からインフォームドコンセントが得られます。 当社は社会経済情報を収集します（例: 収入、教育、家族資産）を測定し、人体測定（体重、身長）、ヘモグロビン状態の評価を実行し、マラリア検出用の厚い血液塗抹標本と薄い血液塗抹標本を準備します。 腸の寄生虫を判定するために便サンプルが収集されます。

III.7. 血液サンプルの処理 全身ストア分析に関与する 60 人の子供については、7 歳から 12 歳の子供を対象とし、ベースラインの被験者の特徴が取得されます。 ベースラインでは、各小児から空腹時の静脈血サンプル (7 mL) が採取されます。 その後、発表どおりに合成され（Tanumihardjo、2001）、大豆油に溶解され、250 μL 容積式ピペットで投与される 1.0 μmol の [14,15]-13C2-酢酸レチニルを経口投与します。 摂取後すぐに、吸収を助けるために小さじ1杯のオリーブオイルを摂取します。 子供たちは白パンとチョコレート風味のヘーゼルナッツペーストの標準的な朝食を食べます。 追跡調査の血液は、投与後14日目にオロダラの診療所の看護師によって採取され、直ちに氷上で保管され、処理のためにボボ・ディウラッソにあるサンテ科学研究所に輸送される。

60 人の学童からなる同じグループの血清サンプルは 3 つのチューブに等分され、-80 ℃ で凍結されます。

すべてのサンプルは、以下に概要を説明するガスクロマトグラフィー燃焼同位体比質量分析法 (GCCIRMS) による分析のために、ウィスコンシン大学マディソン校 (UW) に出荷または手運びされます。

ベースライン血液サンプルは、低サンプル量について以下に説明するように、血清レチニルエステルおよびカロテノイドについても分析されます。

同様の方法は過去にブルキナファソでも使用されており（Bationo et al., 2018）、野菜摂取量が少ないことが明らかになりました。 しかし、その研究が行われて以来、ビタミンA強化オイルが国内で広く入手できるようになりました。 この研究は、ビタミン A 過剰の尺度としての血清レチニルエステルの検証に付加価値を与えるでしょう。

血清からのレチノールの事前精製は、ヒト生体サンプル (血清) の輸送による余分な規制負担を回避するために、1 つのアリコートから保存剤を使用した固相抽出 (SPE) 法を使用して調査されます。 まず、ウィスコンシン大学マディソン校で最適なプロトコルを決定します。 パイロット研究では、NH2 カラムとヘキサン/酢酸エチル溶媒を使用した順相 SPE が血清からのレチノールの回収率と純度が非常に高いことが示唆されており、今後は防腐剤としてのブチル化ヒドロキシトルエンとα-トコフェロールを調査する予定です。 SPE 前精製が現場で使用される場合、GCCIRMS に導入する前に HPLC でレチノールを再精製する予定です。そのため、どの保存料が HPLC 再精製と分析を妨げないかを決定します。

RID 技術が投与時の炎症によってどのような影響を受けるかを調査するために、アフリカの 3 ～ 4 歳の就学前児童を対象とした既存のデータセット。 血清レチノールおよびレチノール結合タンパク質が炎症により一時的に減少することはよく知られている(Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003)。 これは、高レベルの臨床的または不顕性感染症を有する集団におけるビタミン A 状態の推定値に影響を与える可能性があります (Suri et al., 2015; 2021)。 しかし、RID に対する炎症の潜在的な影響は、大規模な小児グループでは評価されていません。 私たちは、ブルキナファソ、エチオピア、カメルーン、南アフリカ、タンザニアの子供たちの体内の総ビタミンA貯蔵量を計算しました。 炎症状態は、投与時に血液サンプルから得られたC反応性タンパク質（CRP）およびα1酸糖タンパク質（AGP）を測定することによって評価されています。 13C-RID 検査に基づく総肝臓予備能 (TLR) と CRP および AGP の連続値との関連を調べ、関係の傾きがゼロに等しくないかどうかをテストします。 また、次の 4 つの炎症カテゴリーを使用して TLR のカテゴリー平均を比較します。炎症なし、潜伏期間 (CRP (>5 mg/L) の上昇のみ)、回復期早期 (CRP および AGP (>1 g/L) の上昇)、およびグループ間の差についてANOVA検定を使用した回復期後期（AGPの上昇のみ）。

MRDR 検査を含む 2 番目の横断研究では、引き続き 7 歳から 12 歳の小児を対象とし、アナログを使用して吸収曲線を評価し、吸収曲線にカプセルを使用して違いがあるかどうかを判断するためにベースラインの被験者の特性が取得されます。

この研究では、カプセル中の標識酢酸レチニルと油中の直接経口投与との類似性として、酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルの吸収を調査します。 上記と同じ認識および感作手順を使用して、小児を 15 人ずつ 6 つのグループに分け、カプセル投与または直接経口投与に無作為に割り当て、0 から 7 時間後までの異なる時点の血液サンプルを採取します。 すべてのサンプルは、3,4-ジデヒドロレチノールおよび 3,4-ジデヒドロレチニル エステルについて分析されます。 アルコールの形態はレチノール結合タンパク質 (RBP) に結合しているものと同等ですが、エステルは吸収曲線を反映します。

すべての子供には、約 200 μL の大豆油に溶解した 7.0 μモルの酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルが投与されます。 MRDR検査におけるビタミンA欠乏症のカットオフは0.060で、これは投与後4～6時間における3,4-ジデヒドロレチノールとレチノールの比です。 したがって、各子供はこの測定値を持つことになります。 2 ～ 5 時間のエステル吸収曲線の下の面積により、経口投与量からのカイミクロン分布が明らかになります。 すべてのサンプルは、MRDR については標準 250 μL メソッドを使用し、3,4-ジデヒドロレチノールおよび 3,4-ジデヒドロレチニル エステルについては拡張 UPLC メソッドを使用して分析されます。

研究には次の 2 つのフェーズがあります。

研究の第一段階はマンゴーの季節（11月から12月）後に実施され、研究の第二段階はマンゴーの季節（4月から5月）に実施されます。

III.8.臨床検査分析

ガスクロマトグラフィー燃焼同位体比質量分析法 (GCCIRMS) によるサンプルの分析:

血清: GCCIRMS 分析のための血清抽出手順と機器は以前に報告されています (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014)。 簡単に言うと、血清を室温で解凍しました。 0.75 mL (または入手可能なすべての血清) にエタノール (1 x vol) を加えてタンパク質を沈殿させ、C23 ベータ-アポ-カロテノールを内部標準として加え、1 mL のヘキサン抽出を 3 回実行します。 ヘキサンをプールし、窒素下で乾燥し、100 μL メタノールに再懸濁し、-80℃で約 5 分間凍結し、短時間遠心分離し、定量と精製のために HPLC システム 1 に注入します。 システム 1 は、92:8 アセトニトリル:水、1.0 mL/min を使用する Gracesmart C18 (5 μm、4.6 x 250 mm) カラムです。 レチノール画分を収集し、窒素下で乾燥させ、システム 2 に注入するために 100 μL メタノールに再懸濁しました。システム 2 は、0.7 mL/min で 100% メタノールを使用する同一のカラムです。 レチノール画分を収集し、SPD1010 SpeedVac を使用して真空乾燥し、4 ～ 6 μL のヘキサンに再懸濁し、1 ～ 3 μL を GC に注入します (約 75 ng を注入するため)。 GC/C/IRMS システムは公開されました (Howe et al., 2009)。 原子% (At%) は、二酸化炭素を基準として直接計算されます (Isodat バージョン 2.0)。ショ糖標準 (NIST、8542) に対して校正されます。

レチニルエステルおよびカロテノイドの分析：血清カロテノイドおよびレチニルエステルは、ウィスコンシン大学マディソン校栄養科学部の研究室で、公表されているとおり（Williams et al., 2021）、超高性能液体クロマトグラフィー（Waters UPLC®）により分析されます。以前に記載された溶媒システム (Gannon et al., 2018)、低サンプル量向けに最適化され、望ましい分析物。 簡単に説明すると、150 μL の血清、または入手可能なすべての血清をホウケイ酸ガラス管 (Fisher Scientific) に等分し、これに 100 μL の C-23 β-アポカロテノール (メタノール中の内部標準光学密度、325 nm で約 1.0) および 225 μL のエタノールを加えます。追加した。 有機化合物を 500 μL のヘキサンで 3 回抽出し、ボルテックスで混合し、1200 重力単位の相対遠心力で 5 分間遠心分離します。 プールされたヘキサン層は、窒素流下で円錐底ガラス管内で乾燥されます。 乾燥抽出物を７５：２５のメタノール：ジクロロエタン濃度７５μＬに再懸濁し、ＵＰＬＣバイアル（Ｗａｔｅｒｓ）に移し、６μＬをＵＰＬＣシステムに注入する。

III.9. プロジェクト完了のための有機合成。 目的 1 および 2 を完了するための 13C-酢酸レチニルの合成。13C2-酢酸レチニルは、Tanumihardjo (2001) によって詳細に公開されている手順を使用して合成されます。 簡単に説明すると、C18-テトラエン ケトンは、市販の前駆体である β-イオノンから合成され、慎重に精製されます。 修正された Whittig-Horner 手順を使用して、C-18 テトラエン ケトンを 13C2 標識トリエチルホスホノアセテートのカルバニオンと反応させ、レチノール部分の主鎖に 2 ～ 13C を付加します。 得られたエチルエステルをアルコールに還元し、無水酢酸でエステル化して酢酸13C2-レチニルとする。 合成オールトランス異性体は、ヘキサンやジエチルエーテルなどの比較的無害で揮発性の高い有機溶媒を使用し、8% 水不活性化アルミナ上で注意深く精製されます。 得られた調製物は、UV-VIS 分光法、TLC、および HPLC を使用して特性評価されます。 長期保存の場合、14,15-13C2-酢酸レチニルは大豆油に溶解して-80℃で保存されます。 研究の直前に最終用量を大豆油で調製し（～200μL/用量）、各研究現場に手で運びます。

目標 4 を完了するための酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルの合成: タヌミハルジョ博士は、ジョージア州アトランタの疾病管理センターで集団ベースの栄養評価に使用するために、酢酸 3,4-ジデヒドロレチニルを定期的に合成しています。 したがって、動態研究に登録されている母親の乳児のビタミン A 状態評価案に、-80℃ で保管されている現在のローテーションストックを使用することに問題はないと考えられます。 Tanumihardjo 研究室のみで使用されている合成手順が公開されています (Barua and Ghosh 1972; Tanumihardjo、Barua、Olson、1987)。 簡単に言うと、レチノイン酸はジアゾメタンでメチル化されます。 得られたメチルレチノエートを二酸化マンガンで酸化して、4=オキソメチルレチノエートを形成します。 注意深く精製および結晶化した後、水素化ホウ素ナトリウムを使用して 4=オキソを 4-OH メチルレチノエートに還元します。 -30℃でヘキサン中で数日間結晶化させた後、4-OHをp-トルエンスルホン酸で脱水し、得られた3,4-ジデヒドロ-メチルレチノエートを精製し、一晩結晶化させます。 最後に、3,4-ジデヒドロ-メチルレチノエートは水素化アルミニウムリチウムで3,4-ジデヒドロレチノールに還元され、すぐに酢酸3,4-ジデヒドロレチニルにアセチル化され、精製され、大豆油に溶解され、用量が調製されカスタマイズされるまで-80℃で保存されます。個人の勉強用に。

III.6. 倫理的クリアランス プロトコールおよびインフォームドコンセントフォームは、IRSS の治験審査委員会で倫理審査を受け、汎アフリカ臨床試験登録簿 (www.pactr.org) に登録されます。 データベースには一意の識別番号が付けられています。 私たちはすでに小児の RID テストに取り組んだ経験があります (Bationo et al., 2019)。

IV.調査作業計画 時間計画、IRSS ブルキナファソの活動 1 年目 2 年目 3 年目 4 年目 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 プロトコルの最終決定 倫理審査と承認 SOP の開発 研究施設の準備 研究スタッフの選定と研修第 1 回目の横断研究の 1 回目 サンプルの準備と保管 第 1 回目の横断研究の 2 回目の回 試料の準備と保管 サンプルの発送2 回目の横断研究 サンプルの準備と保管 2 回目の横断研究の 2 回目 サンプルの準備と保管 サンプルの発送 研究所での分析 データの取り扱い 地方、国内、国際的な普及