Validation et simplification de la technique de dilution isotopique du rétinol chez les écoliers burkinabè (RID_VAB)

Titre du projet Validation et simplification de la technique de dilution isotopique du rétinol chez les écoliers burkinabè

I. Contexte et rationnel Des biomarqueurs du statut en vitamine A qui reflètent l'étalon-or, c'est-à-dire la biopsie hépatique, sont disponibles mais en cours de perfectionnement pour accroître l'accessibilité dans les applications basées sur la population. Les tests de dilution isotopique du rétinol (RID) sont l’un de ces biomarqueurs. Au Burkina Faso, nous avons pu évaluer un test de 7 jours avec un test de 14 jours avec le simple ajout d'un facteur de correction à l'équation de prédiction. Les valeurs des réserves corporelles totales de vitamine A étaient similaires, mais la variation augmentait avec l'augmentation des réserves hépatiques. L'hypothèse selon laquelle 3 % du poids corporel correspond au poids du foie chez les enfants d'âge scolaire a été confirmée comme étant appropriée dans le calcul des réserves totales de vitamine A du foie. La simplification de la dilution isotopique pour l’évaluation de la population et le renforcement des capacités d’analyse par spectrométrie de masse sont des domaines importants du développement de la nutrition pour éclairer les programmes de santé publique. Cette proposition continuera à affiner la méthode pour une utilisation généralisée.

II. L'objectif global Fournir de nouvelles connaissances sur la façon d'utiliser la technique de dilution isotopique du rétinol dans des enquêtes de population plus larges pour évaluer le statut en vitamine A, de la carence à l'excès.

II.1. Objectifs spécifiques Plusieurs objectifs spécifiques ont été définis pour ce CRP. A travers les recherches qui seront menées au Burkina Faso et sur les ensembles de données existants, nous nous concentrerons sur les objectifs spécifiques suivants chez les écoliers.

1. Définir une valeur de réserve hépatique totale excédentaire en vitamine A en appliquant les données sur l'ester rétinylique sérique à jeun chez les écoliers avec le test RID 2. Examiner comment la méthodologie existante peut être simplifiée pour s'adapter aux enquêtes de population sans perte de précision, en utilisant des techniques de purification du rétinol sur site 3. Explorer comment la technique de dilution isotopique du rétinol est affectée par l'inflammation au moment de l'administration en utilisant un ensemble de données existantes chez les enfants africains d'âge préscolaire 4. Examiner la différence d'absorption du Acétate de 3,4-didéhydrorétinyle à partir d'huile et sous forme encapsulée chez les enfants d'âge scolaire.

III. Méthode III.1. Site d'étude et population L'étude proposée sera réalisée dans une école primaire de l'ouest du Burkina Faso, à Orodara, un village à la périphérie de Bobo Dioulasso, où nous ciblerons les enfants âgés de 7 à 12 ans. La plupart des habitants du village sont des agriculteurs à revenus moyens et leurs familles. Le Burkina Faso est l'un des pays impliqués dans le consortium VITAAFRO (Vitamine A en Afrique) qui souhaite déterminer avec précision le statut VA pour éclairer les interventions et politiques existantes.

III.2. Conception de l'étude Deux études transversales successives seront réalisées au cours d'une année scolaire. La première étude au début de l'année scolaire, qui se trouve être la fin de la saison des pluies, et qui est également en dehors de la saison des mangues, et la deuxième étude, 5 à 6 mois plus tard, après la première collecte de données, pendant la saison des mangues, ces études seront menées dans une école primaire de l'ouest du Burkina Faso, à Orodara, un village à la périphérie de Bobo Dioulasso.

III.3. Méthode d'échantillonnage Au total, 158 écoliers seront recrutés de deux manières différentes. Dans un premier temps, un groupe de 60 écoliers sera recruté à travers un échantillonnage stratifié incluant les enfants de la première à la dernière année primaire et proportionnellement à leur nombre par classe. À ce premier groupe de 60 écoliers, un test de dilution isotopique du rétinol (RID) pour l'évaluation des réserves corporelles totales sera appliqué pour comparer les valeurs aux concentrations sériques d'ester de rétinyle à jeun au départ.

Les 98 écoliers restants seront recrutés selon un échantillonnage stratifié et proportionnellement à leur nombre par classe et répartis en deux groupes de 49 enfants selon le sexe (soit 49 femmes et 49 hommes). Chez chaque participant, deux moments de prélèvement sanguin seront effectués. Le participant sera ensuite assigné au hasard pour subir un prélèvement sanguin à H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 et H336 comme spécifié ci-dessous. Une liste de randomisation sera générée à l'aide de tableaux de nombres aléatoires. Nous avons choisi de procéder à une randomisation par blocs plutôt qu'à une simple randomisation, car la première approche nous permettra d'avoir des groupes de comparaison impartiaux qui seront à peu près de la même taille tout au long de l'essai. En utilisant la randomisation par blocs, il y aura toujours un nombre presque égal d'enfants dans chaque groupe d'étude.

Pour ces groupes d'enfants, le test dose-réponse relative modifiée (MRDR), une mesure qualitative du statut en vitamine A sera utilisée pour étudier l'absorption de l'acétate de 3,4-didéhydrorétinyle.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10) , H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Sensibilisation et sensibilisation de la communauté Avant le début de l'étude, nous organiserons une série de réunions avec les principaux décideurs et dirigeants communautaires de la zone d'étude dans le cadre des efforts de sensibilisation et de mobilisation de la communauté pour l'étude. Ces réunions de sensibilisation communautaire informeront la communauté sur l'existence et le but de l'étude ainsi que sur les avantages non seulement pour leurs communautés mais aussi pour le pays et l'Afrique dans son ensemble. Les raisons du choix de la zone pour chacune des études humaines et le design proposé leur seront expliqués.

III.5. Recrutement et sélection

À titre de processus de sélection, une liste des écoliers éligibles sera établie à partir de laquelle la sélection sera effectuée. Les enfants seront éligibles à participer s’ils répondent aux critères de sélection suivants :

III.5.1. Critères d'inclusion :

• Ecoliers âgés de 7 à 12 ans
• Le tuteur ou le parent de l'enfant est prêt à donner son consentement éclairé
• La famille de l'enfant prévoit de rester résidente dans les zones d'étude pendant la période d'étude

III.5.2. Critères d'exclusion :

• Preuve clinique d'une carence en vitamine A a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Malnutrition sévère (score Z poids pour âge (WAZ) ou score Z taille pour âge (HAZ) <-3 SD)
• Maladies graves, notamment tuberculose, infection symptomatique au VIH
• Enfant âgé de <6 ans ou >12 ans III.6. Variables de l'étude Après vérification de l'éligibilité, le consentement éclairé sera obtenu de l'enfant et de son tuteur ou parent. Nous collecterons des informations socio-économiques (par ex. revenu, éducation, patrimoine familial) et effectuer des mesures anthropométriques (poids, taille), évaluer le statut d'hémoglobine et préparer des frottis sanguins épais et minces pour la détection du paludisme. Un échantillon de selles sera collecté pour la détermination des parasites intestinaux.

III.7. Traitement des échantillons de sang Pour les 60 enfants impliqués dans l'analyse des réserves corporelles totales, nous ciblerons les enfants âgés de 7 à 12 ans et les caractéristiques de base du sujet seront obtenues. Au départ, un échantillon de sang veineux à jeun (7 ml) sera prélevé sur chaque enfant. Par la suite, ils recevront une dose orale de 1,0 μmol d'acétate de [14,15]-13C2-rétinyle, qui sera synthétisé tel que publié (Tanumihardjo, 2001), dissous dans l'huile de soja et administré avec une pipette à déplacement positif de 250 microL. La dose sera immédiatement suivie d'une cuillère à café d'huile d'olive pour faciliter l'absorption. Les enfants prendront un petit-déjeuner standardisé composé de pain blanc et de pâte de noisettes au chocolat. Le sang de suivi sera collecté par les infirmières de la clinique d'Orodara le 14e jour après la dose, conservé immédiatement sur de la glace et transporté à l'Institut de Recherche en Sciences de la Santé situé à Bobo-Dioulasso pour traitement.

Les échantillons de sérum du même groupe de 60 écoliers seront aliquotés dans trois tubes et congelés à -80 degrés C.

Tous les échantillons seront expédiés ou transportés manuellement à l'Université du Wisconsin-Madison (UW) pour analyse par chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse à rapport isotopique (GCCIRMS), comme indiqué ci-dessous.

Les échantillons de sang de base seront également analysés pour les esters de rétinyle sériques et les caroténoïdes comme décrit ci-dessous pour de faibles volumes d'échantillons.

Une méthode similaire a été utilisée dans le passé au Burkina Faso (Bationo et al., 2018), qui a révélé une faible consommation de légumes. Cependant, l’huile enrichie en vitamine A est désormais largement disponible dans le pays depuis que cette étude a été réalisée. Cette étude ajoutera de la valeur à la validation des esters rétinyliques sériques comme mesure de l'excès de vitamine A.

Une pré-purification du rétinol du sérum sera étudiée à l'aide de méthodes d'extraction en phase solide (SPE) avec un conservateur à partir d'une aliquote pour éviter la charge réglementaire supplémentaire liée à l'expédition d'échantillons biologiques humains (sérum). Nous déterminerons d'abord les protocoles optimaux à l'Université du Wisconsin - Madison. Des études pilotes ont suggéré que la SPE en phase directe utilisant des colonnes NH2 et des solvants hexane/acétate d'éthyle permet une récupération et une pureté très élevées du rétinol du sérum, et nous étudierons l'hydroxytoluène butylé et l'alpha-tocophérol comme conservateurs. Si la prépurification SPE est utilisée sur le terrain, nous prévoyons de repurifier le rétinol par HPLC avant son introduction dans GCCIRMS, nous déterminerons donc quel conservateur n'interférera pas avec la repurification et l'analyse HPLC.

Un ensemble de données existantes chez des enfants d'âge préscolaire africains âgés de 3 à 4 ans, pour explorer comment la technique RID est affectée par l'inflammation au moment de l'administration. Il est bien connu que le rétinol sérique et la protéine de liaison au rétinol sont temporairement diminués par l'inflammation (Filteau et al., 1993 ; Thurnham et al., 2003). Cela peut affecter les estimations du statut en vitamine A dans les populations présentant des niveaux élevés d’infections cliniques ou subcliniques (Suri et al., 2015 ; 2021). Cependant, l’effet potentiel de l’inflammation sur le RID n’a pas été évalué chez un grand groupe d’enfants. Nous avons calculé les réserves corporelles totales de vitamine A chez des enfants du Burkina Faso, d'Éthiopie, du Cameroun, d'Afrique du Sud et de Tanzanie. L'état d'inflammation a été évalué en mesurant la protéine C-réactive (CRP) et l'alpha1-glycoprotéine acide (AGP) obtenues à partir des échantillons de sang au moment de l'administration. Nous examinerons l'association entre les réserves hépatiques totales (TLR) basées sur le test 13C-RID et les valeurs continues de CRP et d'AGP, en testant si la pente de la relation n'est pas égale à zéro. Nous comparerons également les moyennes catégorielles pour le TLR en utilisant les quatre catégories d'inflammation suivantes : aucune inflammation, incubation (CRP élevée (> 5 mg/L) uniquement), convalescence précoce (CRP et AGP élevées (> 1 g/L)) et convalescence tardive (AGP élevée uniquement) en utilisant un test ANOVA pour les différences entre les groupes.

Pour la deuxième étude transversale impliquant le test MRDR, nous ciblerons toujours les enfants âgés de 7 à 12 ans et les caractéristiques de base du sujet seront obtenues pour évaluer les courbes d'absorption à l'aide d'un analogue et pour déterminer s'il y a une différence en utilisant des capsules dans les courbes d'absorption.

Cette étude examinera l'absorption de l'acétate de 3,4-didéhydrorétinyle par analogie avec l'acétate de rétinyle marqué en capsules par rapport à des doses orales directes dans l'huile. En utilisant les mêmes procédures de sensibilisation et de sensibilisation que celles indiquées ci-dessus, les enfants seront séparés en six groupes de 15 et assignés au hasard à l'administration de capsules ou à une dose orale directe avec différents moments de prélèvement d'échantillons de sang, de 0 à 7 heures plus tard. Tous les échantillons seront analysés pour les esters de 3,4-didéhydrorétinol et de 3,4-didéhydrorétinyl. La forme alcoolique équivaudra à celle qui est liée à la protéine de liaison au rétinol (RBP), tandis que les esters refléteront les courbes d'absorption.

Tous les enfants recevront 7,0 μmole d'acétate de 3, 4-didéhydrorétinyle dissous dans environ 200 μL d'huile de soja. Le seuil de carence en vitamine A pour le test MRDR est de 0,060, ce qui correspond au rapport 3,4-didéhydrorétinol/rétinol 4 à 6 heures après l'administration. Chaque enfant aura donc cette mesure. La zone sous la courbe d'absorption des esters de 2 à 5 heures révélera la distribution des chylomicrons à partir de la dose orale. Tous les échantillons seront analysés à l'aide de la méthode standard de 250 μL pour le MRDR et d'une méthode UPLC étendue pour les esters de 3,4-didéhydrorétinol et de 3,4-didéhydrorétinyl.

L'étude comportera deux phases :

Une première phase de l'étude sera réalisée après la saison des mangues (novembre-décembre) et une deuxième phase de l'étude sera réalisée pendant la saison des mangues (avril-mai).

III.8. Analyse en laboratoire

Analyse des échantillons par chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse à rapport isotopique (GCCIRMS) :

Sérum : des procédures d'extraction de sérum et des instruments pour l'analyse GCCIRMS ont déjà été rapportés (Howe et al., 2009 ; Gannon et al., 2014). En bref, le sérum est décongelé à température ambiante. À 0,75 ml (ou tout ce qui est disponible) de sérum, de l'éthanol (1 x vol) est ajouté pour précipiter les protéines, du bêta-apo-caroténol C23 est ajouté comme étalon interne et 3 x 1 ml d'extractions à l'hexane sont effectuées. Les hexanes sont rassemblés, séchés sous azote, remis en suspension dans 100 µL de méthanol, congelés à -80⁰C pendant environ 5 min, centrifugés brièvement et injectés sur le système HPLC 1 pour quantification et purification. Le système 1 est une colonne Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) avec un rapport 92:8 acétonitrile:eau à 1,0 mL/min. La fraction de rétinol a été collectée, séchée sous azote et remise en suspension dans 100 µL de méthanol pour injection sur le système 2. Le système 2 est une colonne identique avec 100 % de méthanol à 0,7 mL/min. La fraction de rétinol est collectée, séchée sous vide avec un SpeedVac SPD1010, remise en suspension dans 4 à 6 µL d'hexane et 1 à 3 µL injectés (pour injecter environ 75 ng) sur le GC. Le système GC/C/IRMS a été publié (Howe et al., 2009). Le % d'atome (At%) est directement calculé (Isodat version 2.0) en référence au dioxyde de carbone, qui est calibré par rapport à un étalon de saccharose (NIST, 8542).

Analyse des esters de rétinyle et des caroténoïdes : Les caroténoïdes sériques et les esters de rétinyle seront analysés comme publié (Williams et al., 2021) au laboratoire du Département des sciences nutritionnelles de l'Université du Wisconsin-Madison par chromatographie liquide ultra-performance (Waters UPLC®) selon un système de solvants décrit précédemment (Gannon et al., 2018), optimisé pour les faibles volumes d'échantillons et les analytes souhaités. En bref, 150 μL de sérum, ou la totalité disponible, sont aliquotés dans des tubes en verre borosilicate (Fisher Scientific) dans lesquels 100 μL de C-23 β-apo-caroténol (densité optique standard interne dans le méthanol ~ 1,0 à 325 nm) et 225 μL d'éthanol sont ajoutés. ajouté. Les composés organiques sont extraits trois fois avec 500 µL d'hexanes, mélangés au vortex et centrifugés à une force centrifuge relative de 1 200 unités de gravité pendant 5 min. Les couches d'hexane rassemblées sont séchées dans des tubes en verre à fond conique sous un courant d'azote. L'extrait séché est remis en suspension dans 75 µL de concentration méthanol: dichloroéthane 75:25, transféré dans des flacons UPLC (Waters) et 6 µL injectés sur le système UPLC.

III.9. Synthèse organique pour la réalisation du projet. Synthèse de l'acétate de 13C-rétinyle pour la réalisation des objectifs 1 et 2. L'acétate de 13C2-rétinyle sera synthétisé en utilisant une procédure qui a été publiée en détail par Tanumihardjo (2001). En bref, la C18-tétraène cétone est synthétisée à partir de β-ionone, un précurseur disponible dans le commerce, et soigneusement purifiée. En utilisant une procédure de Whittig-Horner modifiée, la tétraène cétone C-18 est mise à réagir avec le carbanion du triéthylphosponoacétate marqué au 13C2 pour ajouter des 2-13C au squelette du fragment rétinol. L'ester éthylique résultant est réduit en alcool et estérifié en acétate de rétinyle 13C2 avec de l'anhydride acétique. L'isomère synthétique tout-trans est soigneusement purifié sur de l'alumine désactivée à 8 % avec de l'eau en utilisant des solvants organiques relativement inoffensifs et hautement volatils, par exemple des hexanes et de l'éther diéthylique. La préparation résultante est caractérisée par spectroscopie UV-VIS, CCM et HPLC. Pour un stockage à long terme, l'acétate de 14, 15-13C2-rétinyle est stocké dissous dans l'huile de soja à -80 °C. Nous préparerons les doses finales dans de l'huile de soja (~ 200 μL/dose) peu de temps avant l'étude et les transporterons manuellement sur chaque site d'étude.

Synthèse de l'acétate de 3,4-didéhydrorétinyle pour la réalisation de l'objectif 4 : Le Dr Tanumihardjo synthétise régulièrement l'acétate de 3,4-didéhydrorétinyle pour les Centers for Disease Control d'Atlanta, en Géorgie, afin de l'utiliser dans leurs évaluations nutritionnelles basées sur la population. Par conséquent, nous ne prévoyons pas de problème dans l'utilisation des stocks tournants actuels stockés à -80 °C pour l'évaluation proposée du statut en vitamine A chez les nourrissons des mères inscrites à l'étude cinétique. Les procédures de synthèse utilisées exclusivement au laboratoire Tanumihardjo sont publiées (Barua et Ghosh 1972 ; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). En bref, l'acide rétinoïque est méthylé avec le diazométhane. Le méthylrétinoate résultant est oxydé avec du dioxyde de manganèse pour former du 4 = oxo méthylrétinoate. Après une purification et une cristallisation minutieuses, le 4=oxo est réduit en 4-OH méthylrétinoate à l'aide de borohydrure de sodium. Après cristallisation dans des hexanes à -30 °C pendant plusieurs jours, le 4-OH est déshydraté avec de l'acide p-toluène sulfonique et le 3,4-didéhydro-méthylrétinoate résultant est purifié et laissé cristalliser pendant une nuit. Enfin, le 3,4-didéhydro-méthylrétinoate est réduit en 3,4-didéhydrorétinol avec de l'hydrure de lithium et d'aluminium et immédiatement acétylé en 3,4-didéhydrorétinylacétate, purifié, dissous dans de l'huile de soja et conservé à -80 °C jusqu'à ce que les doses soient préparées et personnalisées. pour des études individuelles.

III.6. Autorisation éthique Les protocoles et les formulaires de consentement éclairé seront soumis à un examen éthique au sein des comités d'examen institutionnel de l'IRSS et seront enregistrés au registre panafricain des essais cliniques (www.pactr.org) base de données sous un numéro d’identification unique. Nous avons déjà de l'expérience avec le test RID chez les enfants (Bationo et al., 2019).

IV. Plan de travail de l'étude Calendrier, IRSS Burkina Faso Activités Année 1 Année 2 Année 3 Année 4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 Finalisation du protocole Examen éthique et approbation Élaboration de SOP Préparation du site d'étude Sélection et formation du personnel d'étude Premier tour de la première étude transversale Préparation et stockage des échantillons Deuxième tour de la première étude transversale Préparation et stockage des échantillons Expédition des échantillons Premier tour de la seconde étude transversale Préparation et stockage des échantillons Deuxième cycle de la deuxième étude transversale Préparation et stockage des échantillons Expédition des échantillons Analyse en laboratoire Traitement des données Diffusions, locales, nationales, internationales