Validering og forenkling av retinol-isotopfortynningsteknikken hos burkinske skolebarn (RID_VAB)

Prosjekttittel Validering og forenkling av retinol-isotopfortynningsteknikken hos burkinske skolebarn

I. Bakgrunn og rasjonelle biomarkører for vitamin A-status som gjenspeiler gullstandarden, dvs. leverbiopsi, er tilgjengelige, men under foredling for å øke tilgjengeligheten i populasjonsbaserte applikasjoner. Retinol isotopfortynning (RID) testing er en slik biomarkør. I Burkina Faso var vi i stand til å evaluere en 7-d test med en 14-d test med det enkle tillegget av en korreksjonsfaktor til prediksjonsligningen. Verdiene for kroppens totale vitamin A-lagre var like, men variasjonen økte med økende leverreserver. Antakelsen om 3 % av kroppsvekten som levervekt hos barn i skolealder ble bekreftet som hensiktsmessig i beregningen for totale vitamin A-reserver i leveren. Forenkling av isotopfortynning for populasjonsevaluering og bygging av kapasitet for massespektrometrianalyser er viktige områder for ernæringsutvikling for å informere folkehelseprogrammer. Dette forslaget vil fortsette å avgrense metoden for utbredt bruk.

II. Det overordnede målet Å gi ny kunnskap om hvordan man bruker retinol-isotopfortynningsteknikken i større befolkningsundersøkelser for å vurdere vitamin A-status fra mangel til overskudd.

II.1. Spesifikke mål Flere spesifikke mål er skissert for denne CRP. Gjennom forskningen som vil bli utført i Burkina Faso og på eksisterende datasett, vil vi fokusere på følgende spesifikke mål for skolebarn.

1. Å definere en vitamin A-overskytende total leverreserveverdi ved å bruke fastende serumretinylesterdata hos skolebarn med RID-test 2. Å undersøke hvordan den eksisterende metodikken kan forenkles for å passe befolkningsundersøkelser uten tap av nøyaktighet, ved å bruke retinolrenseteknikker på stedet 3. Å utforske hvordan retinol-isotopfortynningsteknikken påvirkes av betennelse ved doseringstidspunktet ved å bruke et eksisterende datasett på afrikansk førskolebarn 4. Å undersøke forskjellen i absorpsjon av 3,4-didehydroretinylacetat fra olje og i innkapslet form hos barn i skolealder.

III. Metode III.1. Studiested og befolkning Den foreslåtte studien vil bli utført på en barneskole i den vestlige delen av Burkina Faso, i Orodara, en landsby i ytterkanten av Bobo Dioulasso, hvor vi vil målrette oss mot barn i alderen 7 til 12 år. De fleste innbyggerne i landsbyen er middelinntektsbønder og deres familier. Burkina Faso er et av landene som er involvert i konsortiet VITAAFRO (Vitamin A i Afrika) som er interessert i å nøyaktig bestemme VA-status for å informere eksisterende intervensjoner og retningslinjer.

III.2. Studiedesign Det skal gjennomføres to suksessive tverrsnittsstudier i løpet av et skoleår. Den første studien ved begynnelsen av skoleåret, som tilfeldigvis er slutten av regnsesongen, og som også er ute av mangosesongen, og den andre studien, 5 til 6 måneder senere, etter det første settet med datainnsamling, i løpet av mangosesongen vil disse studiene bli utført på en barneskole i den vestlige delen av Burkina Faso, i Orodara, en landsby i ytterkanten av Bobo Dioulasso.

III.3. Utvalgsmetode Totalt skal 158 skolebarn rekrutteres på to ulike måter. Ved første gang skal en gruppe på 60 skolebarn rekrutteres gjennom et stratifisert utvalg som inkluderer barn fra første til siste barneskoleår og proporsjonalt med antall per klasse. Til denne første gruppen på 60 skolebarn vil en retinol isotopfortynning (RID) test for total kroppslagrevurdering bli brukt for å sammenligne verdiene med fastende serumretinylesterkonsentrasjoner ved baseline.

De resterende 98 skolebarna vil bli rekruttert i henhold til stratifisert utvalg og proporsjonalt med antall per klasse og delt inn i to grupper på 49 barn etter kjønn (dvs. 49 kvinner og 49 menn). I hver deltaker vil det bli utført to tidspunkter for blodprøvetaking. Deltakeren vil da bli tilfeldig tildelt til å ta blodprøver ved H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 og H336 som spesifisert nedenfor. En randomiseringsliste vil bli generert ved hjelp av tabeller med tilfeldige tall. Vi har valgt å blokkere fremfor enkel randomisering fordi den tidligere tilnærmingen vil tillate oss å ha objektive sammenligningsgrupper som vil være omtrent like store gjennom hele forsøket. Ved å bruke blokkrandomisering vil det alltid være nesten like mange barn i hver studiegruppe.

For disse gruppene av barn vil den modifiserte relative doserespons (MRDR) testen, et kvalitativt mål på vitamin A-status bli brukt for å undersøke absorpsjonen av 3,4-didehydroretinylacetat.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Samfunnsbevissthet og sensibilisering Før studiestart vil vi gjennomføre en serie møter med sentrale beslutningstakere og samfunnsledere i studieområdet som en del av arbeidet med å øke bevisstheten og mobilisere fellesskapet for studiet. Disse samfunnsoppsøkende og sensibiliseringsmøtene vil informere samfunnet om eksistensen og formålet med studien samt fordelene ikke bare for lokalsamfunnene deres, men også for landet og Afrika for øvrig. Årsakene til å velge området for hver av de menneskelige studiene og det foreslåtte designet vil bli forklart for dem.

III.5. Rekruttering og screening

Som en screeningsprosess vil det bli laget en liste over de kvalifiserte skoleelevene som utvalget vil bli utført fra. Barn vil være kvalifisert til å delta hvis de oppfyller følgende screeningskriterier:

III.5.1. Inkluderingskriterier:

• Skolebarn i alderen 7-12 år
• Barnets foresatte eller forelder er villig til å gi informert samtykke
• Barns familie planlegger å forbli bosatt i studieområdene i studieperioden

III.5.2. Ekskluderingskriterier:

• Klinisk bevis på vitamin A-mangel a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Alvorlig underernæring (vekt-for alder Z-score (WAZ) eller høyde-for-alder Z-score (HAZ) <-3 SD)
• Alvorlige sykdommer inkludert tuberkulose, symptomatisk HIV-infeksjon
• Barn <6 år eller >12 år III.6. Studievariabler Etter screening for kvalifisering, vil informert samtykke innhentes fra barnet og deres omsorgsperson eller forelder. Vi vil samle inn sosioøkonomisk informasjon (f.eks. inntekt, utdanning, familieformue) og utføre antropometriske målinger (vekt, høyde), vurdering av hemoglobinstatus og forberede tykke og tynne blodutstryk for malariadeteksjon. En avføringsprøve vil bli samlet inn for bestemmelse av tarmparasitter.

III.7. Behandling av blodprøver For de 60 barna som er involvert i totalkroppsanalysen, vil vi målrette oss mot barn i alderen 7 til 12 år, og baseline-fagkarakteristika vil bli oppnådd. Ved baseline vil en fastende venøs blodprøve (7 ml) bli tatt på hvert barn. Deretter vil de få en oral dose på 1,0 μmol [14,15]-13C2-retinylacetat, som vil bli syntetisert som publisert (Tanumihardjo, 2001), oppløst i soyaolje og administrert med en 250 mikroL positiv fortrengningspipette. Dosen vil umiddelbart etterfølges av en teskje olivenolje for å hjelpe absorpsjonen. Barn vil spise en standardisert frokost med hvitt brød og hasselnøttpasta med sjokoladesmak. Oppfølgingsblodet vil bli samlet inn av Orodaras klinikksykepleiere på dag 14 etter dosen, lagret umiddelbart på is, og transportert til Institut de Recherche en Sciences de la Santé i Bobo-Dioulasso for behandling.

Serumprøvene fra samme gruppe på 60 skolebarn vil bli delt opp i tre rør og frosset ved -80 grader C.

Alle prøver vil bli sendt eller håndbåret til University of Wisconsin-Madison (UW) for analyse ved gasskromatografi-forbrenning-isotopforhold massespektrometri (GCCIRMS) som skissert nedenfor.

Baseline-blodprøvene vil også bli analysert for serumretinylestere og karotenoider som beskrevet nedenfor for lave prøvevolum.

Tilsvarende metode har vært brukt i Burkina Faso tidligere (Bationo et al., 2018), som avslørte lavt grønnsaksinntak. Imidlertid har vitamin A-forsterket olje nå blitt allment tilgjengelig i landet siden den studien ble gjort. Denne studien vil tilføre verdi til valideringen av serumretinylestere som et mål på vitamin A-overskudd.

En forhåndsrensing av retinol fra serum vil bli undersøkt ved bruk av fast-fase ekstraksjon (SPE) metoder med konserveringsmiddel fra en alikvot for å unngå den ekstra regulatoriske byrden med å sende humane biologiske prøver (serum). Vi vil først bestemme optimale protokoller ved University of Wisconsin - Madison. Pilotstudier har antydet at frem-fase SPE ved bruk av NH2 kolonner og heksan/etylacetat løsemidler har svært høy utvinning og renhet av retinol fra serum, og vi vil undersøke butylert hydroksytoluen og alfa-tokoferol som konserveringsmidler. Hvis SPE-forrensing brukes i feltet, vil vi planlegge å rense retinolen ved HPLC før introduksjon i GCCIRMS, så vi vil bestemme hvilket konserveringsmiddel som ikke vil forstyrre HPLC-gjenrensing og analyse.

Et eksisterende datasett i afrikanske førskolebarn i alderen 3 til 4 år, for å utforske hvordan RID-teknikken påvirkes av betennelse ved doseringstidspunktet. Det er velkjent at serumretinol og retinolbindende protein reduseres midlertidig ved betennelse (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Dette kan påvirke estimater av vitamin A-status i populasjoner med høye nivåer av kliniske eller subkliniske infeksjoner (Suri et al., 2015; 2021). Imidlertid er den potensielle effekten av betennelse på RID ikke evaluert hos en stor gruppe barn. Vi har beregnet totale kroppens vitamin A-lagre hos barn fra Burkina Faso, Etiopia, Kamerun, Sør-Afrika og Tanzania. Betennelsesstatus har blitt vurdert ved å måle C-reaktivt protein (CRP) og alfa1-syreglykoprotein (AGP) oppnådd fra blodprøvene ved doseringstidspunktet. Vi vil se på sammenhengen mellom totale leverreserver (TLR) basert på 13C-RID-testen og kontinuerlige verdier av CRP og AGP, og teste om helningen på forholdet ikke er lik null. Vi vil også sammenligne kategoriske middel for TLR ved å bruke følgende fire kategorier av betennelse: ingen betennelse, inkubasjon (kun forhøyet CRP (>5 mg/L)), tidlig rekonvalesens (forhøyet CRP og AGP (>1 g/L)), og sen rekonvalesens (kun forhøyet AGP) ved bruk av en ANOVA-test for forskjeller mellom grupper.

For den andre tverrsnittsstudien som involverer MRDR-test, vil vi fortsatt målrette mot barn i alderen 7 til 12 år og baseline-fagkarakteristikker vil bli oppnådd for å evaluere absorpsjonskurver ved bruk av en analog og for å bestemme om det er en forskjell ved bruk av kapsler i absorpsjonskurvene.

Denne studien vil undersøke absorpsjonen av 3,4-didehydroretinylacetat som en analogi til merket retinylacetat i kapsler versus direkte orale doser i olje. Ved å bruke samme bevisstgjøring og sensibiliseringsprosedyrer som nevnt ovenfor, vil barn bli delt inn i seks grupper på 15 og tilfeldig tildelt kapseladministrering eller direkte oral dose med forskjellig tidspunkt for innsamling av blodprøver, fra 0 til 7 timer senere. Alle prøver vil bli analysert for 3,4-didehydroretinol og 3,4-didehydroretinylestere. Alkoholformen vil tilsvare den som er bundet til retinolbindende protein (RBP), mens esterne vil reflektere absorpsjonskurvene.

Alle barn vil motta 7,0 μmol 3, 4-didehydroretinylacetat oppløst i ca. 200 μL soyaolje. Cutoff for vitamin A-mangel for MRDR-testen er 0,060, som er forholdet 3,4-didehydroretinol til retinol 4 til 6 timer etter dosering. Derfor vil hvert barn ha denne målingen. Området under esterabsorpsjonskurven fra 2 til 5 timer vil avsløre chylomikronfordelingen fra den orale dosen. Alle prøver vil bli analysert med standard 250 μL-metoden for MRDR og en utvidet UPLC-metode for 3,4-didehydroretinol og 3,4-didehydroretinylestere.

Studien vil ha to faser:

En innledende fase vil bli utført etter mangosesongen (november-desember) og en andre fase av studien vil bli utført i løpet av mangosesongen (april-mai).

III.8. Laboratorieanalyse

Analyse av prøver ved gasskromatografi-forbrenning-isotopforhold massespektrometri (GCCIRMS):

Serum: Serumekstraksjonsprosedyrer og instrumentering for GCCIRMS-analyse er tidligere rapportert (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Kort sagt, serum oss tint ved romtemperatur. Til 0,75 ml (eller alt tilgjengelig) serum tilsettes etanol (1 x volum) for å utfelle proteiner, C23 beta-apo-karotenol tilsettes som en intern standard, og 3 x 1 ml heksanekstraksjoner utføres. Heksaner slås sammen, tørkes under nitrogen, resuspenderes i 100 μL metanol, fryses ved -80 ⁰C i ~5 minutter, sentrifugeres kort og injiseres på HPLC-system 1 for kvantifisering og rensing. System 1 er en Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) kolonne med 92:8 acetonitril:vann ved 1,0 ml/min. Retinolfraksjonen ble samlet opp, tørket under nitrogen og resuspendert i 100 μL metanol for injeksjon på system 2. System 2 er en identisk kolonne med 100 % metanol ved 0,7 mL/min. Retinolfraksjonen samles opp, tørkes under vakuum med en SPD1010 SpeedVac, resuspenderes i 4-6 μL heksan, og 1-3 μL injiseres (for å injisere ca. 75 ng) på GC. GC/C/IRMS-systemet ble publisert (Howe et al., 2009). Atom % (At%) er direkte beregnet (Isodat versjon 2.0) med referanse til karbondioksid, som er kalibrert mot en sukrosestandard (NIST, 8542).

Retinylester og karotenoidanalyse: Serumkarotenoider og retinylestere vil bli analysert som publisert (Williams et al., 2021) ved University of Wisconsin-Madison Department of Nutritional Sciences laboratorium ved hjelp av ultraytelses væskekromatografi (Waters UPLC®) i henhold til en tidligere beskrevet løsningsmiddelsystem (Gannon et al., 2018), optimert for lave prøvevolum og ønskede analytter. Kort fortalt blir 150 μL serum, eller alt tilgjengelig, delt opp i borosilikatglassrør (Fisher Scientific) som 100 μL C-23 β-apo-karotenol (intern standard optisk tetthet i metanol ~1,0 ved 325 nm) og 225 μL etanol lagt til. Organiske forbindelser ekstraheres tre ganger med 500 μL heksaner, blandes med en virvel og sentrifugeres ved relativ sentrifugalkraft på 1200 tyngdeenheter i 5 minutter. Sammenslåtte heksanlag tørkes i glassrør med konisk bunn under en strøm av nitrogen. Det tørkede ekstraktet resuspenderes i 75 μL 75:25 metanol:dikloretan-konsentrasjon, overføres til UPLC-ampuller (Waters) og 6 μL injiseres i UPLC-systemet.

III.9. Organisk syntese for gjennomføring av prosjektet. Syntese av 13C-retinylacetat for fullføring av mål 1 og 2. 13C2-retinylacetat vil bli syntetisert ved hjelp av en prosedyre som er publisert i detalj av Tanumihardjo (2001). Kort fortalt syntetiseres C18-tetraenketon fra β-ionon, en kommersielt tilgjengelig forløper, og renses nøye. Ved å bruke en modifisert Whittig-Horner-prosedyre blir C-18-tetraenketon reagert med karbanionen av 13C2-merket trietylfosponoacetat for å tilsette 2-13C til ryggraden i retinoldelen. Den resulterende etylesteren reduseres til alkoholen og forestres til 13C2-retinylacetat med eddiksyreanhydrid. Den syntetiske all-trans-isomeren renses forsiktig på 8 % vann-deaktivert alumina ved bruk av relativt ufarlige, svært flyktige, organiske løsningsmidler, f.eks. heksaner og dietyleter. Det resulterende preparatet karakteriseres ved bruk av UV-VIS-spektroskopi, TLC og HPLC. For langtidslagring lagres 14, 15-13C2-retinylacetatet oppløst i soyaolje ved -80oC. Vi vil tilberede de siste dosene i soyaolje (~200 μL/dose) kort før studien og håndbære dem til hvert studiested.

Syntese av 3,4-didehydroretinylacetat for fullføring av mål 4: Dr. Tanumihardjo syntetiserer rutinemessig 3,4-didehydroretinylacetat for Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, for å bruke i deres befolkningsbaserte ernæringsevalueringer. Derfor ser vi ikke noe problem med å bruke nåværende roterende bestander som er lagret ved -80oC for den foreslåtte vitamin A-statusevalueringen hos spedbarnene til mødrene som er registrert i den kinetiske studien. De syntetiske prosedyrene som utelukkende brukes i Tanumihardjo-laboratoriet er publisert (Barua og Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Kort fortalt er retinsyre metylert med diazometan. Det resulterende metylretinoatet oksideres med mangandioksyd for å danne 4=oksometylretinoat. Etter nøye rensing og krystallisering reduseres 4=oxo til 4-OH-metylretinoat ved bruk av natriumborhydrid. Etter krystallisering i heksaner ved -30oC i flere dager, dehydreres 4-OH med p-toluensulfonsyre og det resulterende 3,4-didehydro-metylretinoatet renses og får krystallisere over natten. Til slutt reduseres 3,4-didehydro-metylretinoat til 3,4-didehydroretinol med litiumaluminiumhydrid og acetyleres umiddelbart til 3,4-didehydroretinylacetat, renses, oppløses i soyaolje og lagres ved -80oC inntil doser er klargjort og tilpasset. for individuelle studier.

III.6. Etisk godkjenning Protokollene og skjemaene for informert samtykke vil gjennomgå etisk gjennomgang i Institutional Review Boards of IRSS og vil bli registrert hos Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org) database under et unikt identifikasjonsnummer. Vi har allerede erfaring med å jobbe med RID-testen hos barn (Bationo et al., 2019).

IV. Studiearbeidsplan Tidsplan, IRSS Burkina Faso Aktiviteter År 1 år 2 År 3 År 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q3 Q3 Q4 Protokoll sluttføring Etisk gjennomgang og godkjenning SOPs utvikling Studiested forberedelse Valg og opplæring av studiepersonell Første runde av den første tverrsnittsstudien Prøveklargjøring og oppbevaring Andre runde av første tverrsnittsundersøkelse studie Prøveforberedelse og lagring Prøveforsendelse Første runde av den andre tverrsnittsstudien Prøveklargjøring og lagring Andre runde av den andre tverrsnittsstudien Prøveforberedelse og oppbevaring Prøveforsendelse Laboratorieanalysert Datahåndtering Formidling, lokalt, nasjonalt, internasjonalt