Walidacja i uproszczenie techniki rozcieńczania izotopu retinolu u dzieci w wieku szkolnym w Burkinabe (RID_VAB)

Tytuł projektu Walidacja i uproszczenie techniki rozcieńczania izotopu retinolu u dzieci w wieku szkolnym w Burkinabe

I. Kontekst i uzasadnienie Biomarkery poziomu witaminy A odzwierciedlające złoty standard, tj. biopsję wątroby, są dostępne, ale są w trakcie udoskonalania w celu zwiększenia dostępności w zastosowaniach populacyjnych. Jednym z takich biomarkerów jest badanie rozcieńczenia izotopu retinolu (RID). W Burkina Faso byliśmy w stanie ocenić test 7-dniowy za pomocą testu 14-dniowego, po prostu dodając współczynnik korygujący do równania predykcyjnego. Wartości całkowitych zapasów witaminy A w organizmie były podobne, ale różnice zwiększały się wraz ze wzrostem rezerw wątroby. Przyjęcie 3% masy ciała jako masy wątroby u dzieci w wieku szkolnym zostało potwierdzone jako właściwe w obliczeniach całkowitych rezerw witaminy A w wątrobie. Uproszczenie rozcieńczania izotopów na potrzeby oceny populacji i budowanie możliwości analiz spektrometrii mas to ważne obszary rozwoju żywienia, które mają służyć informowaniu programów zdrowia publicznego. Niniejsza propozycja będzie w dalszym ciągu udoskonalać tę metodę w celu umożliwienia jej powszechnego stosowania.

II. Cel ogólny Dostarczenie nowej wiedzy na temat stosowania techniki rozcieńczania izotopów retinolu w badaniach na większej populacji w celu oceny stanu witaminy A od niedoboru do nadmiaru.

II.1. Cele szczegółowe W niniejszym CRP określono kilka celów szczegółowych. Poprzez badania, które zostaną przeprowadzone w Burkina Faso i na istniejących zbiorach danych, skupimy się na następujących konkretnych celach u dzieci w wieku szkolnym.

1. Zdefiniowanie wartości nadmiaru całkowitej rezerwy wątrobowej witaminy A poprzez zastosowanie danych dotyczących estrów retinylu w surowicy na czczo u dzieci w wieku szkolnym za pomocą testu RID 2. Zbadanie, w jaki sposób można uprościć istniejącą metodologię, aby pasowała do badań populacji bez utraty dokładności, stosując techniki oczyszczania retinolu na miejscu 3. Zbadanie, w jaki sposób technika rozcieńczania izotopu retinolu wpływa na stan zapalny w momencie dawkowania, korzystając z istniejącego zestawu danych u afrykańskich dzieci w wieku przedszkolnym. 4. Zbadanie różnicy we wchłanianiu Octan 3,4-didehydroretinylu z oleju i w postaci kapsułkowanej u dzieci w wieku szkolnym.

III. Metoda III.1. Miejsce badania i populacja Proponowane badanie zostanie przeprowadzone w szkole podstawowej w zachodniej części Burkina Faso, w Orodara, wiosce na zewnętrznym obrzeżu Bobo Dioulasso, do której skierowane będą dzieci w wieku od 7 do 12 lat. Większość mieszkańców wsi to rolnicy o średnich dochodach i ich rodziny. Burkina Faso jest jednym z krajów zaangażowanych w konsorcjum VITAAFRO (witamina A w Afryce), które jest zainteresowane dokładnym określeniem statusu VA w celu informowania o istniejących interwencjach i politykach.

III.2. Schemat studiów W ciągu roku szkolnego realizowane będą dwa kolejne badania przekrojowe. Pierwsze badanie przeprowadzone na początku roku szkolnego, który przypada na koniec pory deszczowej i który jest również poza sezonem na mango, a drugie badanie, 5–6 miesięcy później, po pierwszym zbiorze danych, wykazało, że w sezonie mango zajęcia te będą prowadzone w szkole podstawowej w zachodniej części Burkina Faso, w Orodara, wiosce na obrzeżach Bobo Dioulasso.

III.3. Metoda doboru próby Ogółem na dwa różne sposoby rekrutowanych będzie 158 uczniów. W pierwszym etapie rekrutacja grupy 60 uczniów zostanie dokonana w drodze losowania warstwowego, obejmującego dzieci od pierwszego do ostatniego roku szkoły podstawowej i proporcjonalnie do ich liczebności w klasie. W przypadku tej pierwszej grupy 60 dzieci w wieku szkolnym zostanie zastosowany test rozcieńczenia izotopu retinolu (RID) w celu oceny całkowitych zapasów w organizmie w celu porównania wartości z wyjściowymi stężeniami estrów retinylu w surowicy na czczo.

Pozostałych 98 uczniów zostanie rekrutowanych według losowania warstwowego i proporcjonalnie do ich liczby w klasach i podzielonych na dwie grupy po 49 dzieci ze względu na płeć (tj. 49 kobiet i 49 mężczyzn). U każdego uczestnika zostanie wykonane pobieranie krwi w dwóch punktach czasowych. Uczestnik zostanie następnie losowo przydzielony do pobrania próbek krwi w H0, H2, H3, H4, H5, H6, H8, H10, H24, H72, H168 i H336, jak określono poniżej. Lista randomizacyjna zostanie wygenerowana przy użyciu tabel liczb losowych. Zdecydowaliśmy się na blokowanie zamiast prostej randomizacji, ponieważ pierwsze podejście pozwoli nam uzyskać bezstronne grupy porównawcze, które będą mniej więcej tej samej wielkości przez cały czas trwania badania. Dzięki zastosowaniu randomizacji blokowej w każdej grupie badawczej będzie zawsze prawie równa liczba dzieci.

W przypadku tych grup dzieci, do zbadania wchłaniania octanu 3,4-didehydroretynylu, zostanie zastosowany test zmodyfikowanej reakcji względnej dawki (MRDR), będący jakościową miarą poziomu witaminy A.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10) , H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Świadomość i uwrażliwianie społeczności Przed rozpoczęciem badania przeprowadzimy serię spotkań z kluczowymi decydentami i liderami społeczności na obszarze objętym badaniem w ramach działań mających na celu podniesienie świadomości i mobilizację społeczności do badania. Te spotkania informacyjne i uwrażliwiające społeczność poinformują ją o istnieniu i celu badania, a także korzyściach nie tylko dla ich społeczności, ale także dla kraju i całej Afryki. Zostaną im wyjaśnione powody wyboru terenu dla każdego z badań człowieka oraz proponowany projekt.

III.5. Rekrutacja i weryfikacja

W ramach procesu selekcji zostanie sporządzona lista uprawnionych uczniów, spośród której zostanie przeprowadzona selekcja. Dzieci będą mogły wziąć udział w konkursie, jeśli spełnią następujące kryteria kwalifikacyjne:

III.5.1. Kryteria włączenia:

• Dzieci w wieku szkolnym w wieku 7-12 lat
• Opiekun dziecka lub rodzic jest skłonny wyrazić świadomą zgodę
• Rodzina dziecka planuje pozostać na obszarach objętych badaniem w okresie objętym badaniem

III.5.2. Kryteria wykluczenia:

• Kliniczne dowody niedoboru witaminy A a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Poważne niedożywienie (wskaźnik Z w stosunku do masy ciała (WAZ) lub wskaźnik Z w stosunku do wzrostu (HAZ) <-3 SD)
• Poważne choroby, w tym gruźlica, objawowe zakażenie wirusem HIV
• Dziecko w wieku <6 lat lub >12 lat III.6. Zmienne badania Po sprawdzeniu kwalifikowalności uzyskana zostanie świadoma zgoda od dziecka i jego opiekuna lub rodzica. Będziemy zbierać informacje społeczno-ekonomiczne (np. dochód, wykształcenie, majątek rodzinny) oraz wykonać pomiary antropometryczne (waga, wzrost), ocenić poziom hemoglobiny, przygotować grube i cienkie rozmazy krwi do wykrywania malarii. Zostanie pobrana próbka kału w celu oznaczenia pasożytów jelitowych.

III.7. Przetwarzanie próbek krwi W przypadku 60 dzieci objętych analizą całkowitego składu ciała skupimy się na dzieciach w wieku od 7 do 12 lat i uzyskamy wyjściową charakterystykę pacjentów. Na początku od każdego dziecka zostanie pobrana próbka krwi żylnej na czczo (7 ml). Następnie otrzymają doustną dawkę 1,0 μmol octanu [14,15]-13C2-retinylu, który zostanie zsyntetyzowany zgodnie z publikacją (Tanumihardjo, 2001), rozpuszczony w oleju sojowym i podawany za pomocą pipety wyporowej o pojemności 250 mikrol. Natychmiast po dawce zostanie podana jedna łyżeczka oliwy z oliwek, aby ułatwić wchłanianie. Dzieci będą miały standardowe śniadanie składające się z białego pieczywa i pasty z orzechów laskowych o smaku czekoladowym. Krew kontrolna zostanie pobrana przez pielęgniarki kliniki Orodara 14 dnia po podaniu dawki, natychmiast przechowywana w lodzie i transportowana do Institut de Recherche en Sciences de la Santé w Bobo-Dioulasso w celu przetworzenia.

Próbki surowicy tej samej grupy 60 dzieci w wieku szkolnym zostaną podzielone na trzy probówki i zamrożone w temperaturze -80 stopni C.

Wszystkie próbki zostaną wysłane lub przeniesione ręcznie na Uniwersytet Wisconsin-Madison (UW) w celu analizy metodą chromatografii gazowej-spalania-spektrometrii masowej stosunku izotopów (GCCIRMS), jak opisano poniżej.

Wyjściowe próbki krwi będą również analizowane pod kątem estrów retinylu i karotenoidów w surowicy, jak opisano poniżej dla małych objętości próbek.

Podobną metodę zastosowano w przeszłości w Burkina Faso (Bationo i in., 2018), co wykazało niskie spożycie warzyw. Jednakże od czasu przeprowadzenia tego badania olej wzbogacony witaminą A stał się obecnie powszechnie dostępny w kraju. Badanie to wniesie wartość dodaną do walidacji estrów retinylu w surowicy jako miary nadmiaru witaminy A.

Wstępne oczyszczanie retinolu z surowicy zostanie zbadane przy użyciu metod ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z konserwantem z jednej porcji, aby uniknąć dodatkowych obciążeń regulacyjnych związanych z transportem ludzkich próbek biologicznych (surowicy). Najpierw określimy optymalne protokoły na Uniwersytecie Wisconsin – Madison. Badania pilotażowe sugerują, że SPE z fazą przednią przy użyciu kolumn NH2 i rozpuszczalników heksan/octan etylu zapewnia bardzo wysoki odzysk i czystość retinolu z surowicy, dlatego zbadamy butylowany hydroksytoluen i alfa-tokoferol jako środki konserwujące. Jeśli w terenie stosowane jest wstępne oczyszczanie SPE, planujemy ponowne oczyszczenie retinolu metodą HPLC przed wprowadzeniem do GCCIRMS, dzięki czemu ustalimy, który środek konserwujący nie będzie zakłócał ponownego oczyszczania i analizy HPLC.

Istniejący zbiór danych dotyczący afrykańskich dzieci w wieku przedszkolnym w wieku od 3 do 4 lat mający na celu zbadanie, w jaki sposób stan zapalny w momencie dawkowania wpływa na technikę RID. Dobrze wiadomo, że poziom retinolu w surowicy i białka wiążącego retinol są przejściowo obniżone w wyniku stanu zapalnego (Filteau i in., 1993; Thurnham i in., 2003). Może to mieć wpływ na szacunki poziomu witaminy A w populacjach z wysokim poziomem infekcji klinicznych lub subklinicznych (Suri i in., 2015; 2021). Nie oceniano jednak potencjalnego wpływu stanu zapalnego na RID w dużej grupie dzieci. Obliczyliśmy całkowite zapasy witaminy A w organizmie dzieci z Burkina Faso, Etiopii, Kamerunu, Republiki Południowej Afryki i Tanzanii. Stan zapalny oceniano poprzez pomiar białka C-reaktywnego (CRP) i kwaśnej glikoproteiny alfa1 (AGP) uzyskanych z próbek krwi w momencie dawkowania. Przyjrzymy się powiązaniu całkowitych rezerw wątroby (TLR) na podstawie testu 13C-RID z ciągłymi wartościami CRP i AGP, sprawdzając, czy nachylenie zależności nie jest równe zeru. Porównamy także średnie kategoryczne dla TLR przy użyciu następujących czterech kategorii stanu zapalnego: brak zapalenia, inkubacja (podwyższone CRP (tylko > 5 mg/l)), wczesna rekonwalescencja (podwyższone CRP i AGP (> 1 g/l)) oraz późna rekonwalescencja (tylko podwyższone AGP) przy użyciu testu ANOVA dla różnic między grupami.

W drugim badaniu przekrojowym obejmującym test MRDR nadal będziemy skupiać się na dzieciach w wieku od 7 do 12 lat i uzyskana zostanie wyjściowa charakterystyka pacjentów w celu oceny krzywych wchłaniania przy użyciu analogu i określenia, czy istnieje różnica w krzywych wchłaniania przy użyciu kapsułek.

W tym badaniu zbadana zostanie absorpcja octanu 3,4-didehydroretinylu jako analogii do znakowanego octanu retinylu w kapsułkach w porównaniu z bezpośrednimi dawkami doustnymi w oleju. Stosując te same procedury uświadamiania i uwrażliwiania, jak opisano powyżej, dzieci zostaną podzielone na sześć grup po 15 osób i losowo przydzielone do podawania kapsułek lub bezpośredniej dawki doustnej w różnym momencie pobrania próbek krwi, od 0 do 7 godzin później. Wszystkie próbki zostaną poddane analizie na obecność estrów 3,4-didehydroretinolu i 3,4-didehydroretinolu. Forma alkoholu będzie odpowiadać tej, która jest związana z białkiem wiążącym retinol (RBP), podczas gdy estry będą odzwierciedlać krzywe wchłaniania.

Wszystkie dzieci otrzymają 7,0 µmol octanu 3,4-didehydroretinylu rozpuszczonego w około 200 µl oleju sojowego. Wartość graniczna niedoboru witaminy A w teście MRDR wynosi 0,060, co odpowiada stosunkowi 3,4-didehydroretinolu do retinolu po 4 do 6 godzinach po podaniu. Dlatego każde dziecko będzie miało ten pomiar. Pole pod krzywą wchłaniania estrów od 2 do 5 godzin pokaże rozkład chylomikronów po podaniu doustnym. Wszystkie próbki zostaną poddane analizie standardową metodą 250 μL dla MRDR oraz rozszerzoną metodą UPLC dla estrów 3,4-didehydroretinolu i 3,4-didehydroretinylu.

Badanie będzie składało się z dwóch etapów:

Faza wstępna zostanie przeprowadzona po sezonie mango (listopad-grudzień), a druga faza badania zostanie przeprowadzona w sezonie mango (kwiecień-maj).

III.8. Analiza laboratoryjna

Analiza próbek metodą chromatografii gazowej-spalania-spektrometrii mas ze stosunkiem izotopów (GCCIRMS):

Surowica: Procedury ekstrakcji surowicy i instrumentarium do analizy GCCIRMS opisano już wcześniej (Howe i in., 2009; Gannon i in., 2014). W skrócie, surowicę rozmrożono w temperaturze pokojowej. Do 0,75 ml (lub całej dostępnej) surowicy dodaje się etanol (1 x obj.) w celu wytrącenia białek, dodaje się beta-apokarotenol C23 jako wzorzec wewnętrzny i przeprowadza się ekstrakcje heksanem 3 x 1 ml. Heksany łączy się, suszy w atmosferze azotu, ponownie zawiesza w 100 µl metanolu, zamraża w temperaturze -80°C na ~5 min, krótko odwirowuje i wstrzykuje do układu HPLC 1 w celu oznaczenia ilościowego i oczyszczenia. System 1 to kolumna Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) z acetonitrylem:wodą 92:8 przy 1,0 ml/min. Zebraną frakcję retinolu, wysuszono w atmosferze azotu i ponownie zawieszono w 100 µl metanolu w celu wstrzyknięcia do układu 2. Układ 2 to identyczna kolumna ze 100% metanolem przy 0,7 ml/min. Zbiera się frakcję retinolu, suszy pod próżnią za pomocą SPD1010 SpeedVac, ponownie zawiesza w 4-6 µl heksanu i wstrzykuje 1-3 µl (w celu wstrzyknięcia około 75 ng) do GC. Opublikowano system GC/C/IRMS (Howe i in., 2009). % atomów (At%) oblicza się bezpośrednio (Isodat wersja 2.0) w odniesieniu do dwutlenku węgla, który jest kalibrowany względem wzorca sacharozy (NIST, 8542).

Analiza estrów retinylu i karotenoidów: Karotenoidy i estry retinylu w surowicy zostaną poddane analizie zgodnie z publikacją (Williams et al., 2021) w laboratorium Wydziału Nauk o Żywieniu Uniwersytetu Wisconsin-Madison za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (Waters UPLC®) zgodnie z opisany wcześniej układ rozpuszczalników (Gannon i in., 2018), zoptymalizowany pod kątem małych objętości próbek i pożądanych analitów. W skrócie, 150 µl surowicy lub całej dostępnej surowicy dzieli się na porcje do probówek ze szkła borokrzemianowego (Fisher Scientific), do których dodaje się 100 µl C-23 β-apo-karotenolu (wewnętrzny standard gęstości optycznej w metanolu ~1,0 przy 325 nm) i 225 µl etanolu w dodatku. Związki organiczne ekstrahuje się trzykrotnie 500 µl heksanów, miesza wirowo i odwirowuje przy względnej sile odśrodkowej 1200 jednostek ciężkości przez 5 minut. Połączone warstwy heksanu suszy się w szklanych probówkach ze stożkowym dnem w strumieniu azotu. Wysuszony ekstrakt ponownie zawiesza się w 75 µl stężenia metanol:dichloroetan 75:25, przenosi do fiolek UPLC (Waters) i 6 µl wstrzykuje do systemu UPLC.

III.9. Synteza organiczna na zakończenie projektu. Synteza octanu 13C-retinylu w celu realizacji Celów 1 i 2. Octan 13C2-retinylu zostanie zsyntetyzowany przy użyciu procedury szczegółowo opublikowanej przez Tanumihardjo (2001). W skrócie, keton C18-tetraenowy syntetyzuje się z β-jononu, dostępnego na rynku prekursora, i dokładnie oczyszcza. Stosując zmodyfikowaną procedurę Whittiga-Hornera, tetraenoketon C-18 poddaje się reakcji z karboanionem trietylofosfonooctanu znakowanego 13C2 w celu dodania 2-13C do szkieletu ugrupowania retinolu. Powstały ester etylowy redukuje się do alkoholu i estryfikuje do octanu 13C2-retinylu za pomocą bezwodnika octowego. Syntetyczny izomer all-trans oczyszcza się ostrożnie na 8% dezaktywowanym wodą tlenku glinu przy użyciu stosunkowo nieszkodliwych, wysoce lotnych rozpuszczalników organicznych, np. heksanów i eteru dietylowego. Powstały preparat scharakteryzowano za pomocą spektroskopii UV-VIS, TLC i HPLC. W celu długotrwałego przechowywania octan 14,15-13C2-retinylu przechowuje się w postaci rozpuszczonej w oleju sojowym w temperaturze -80oC. Ostateczne dawki przygotujemy w oleju sojowym (~200 µl/dawkę) na krótko przed badaniem i będziemy je ręcznie przenosić do każdego miejsca badania.

Synteza octanu 3,4-didehydroretynylu na potrzeby realizacji Celu 4: Dr Tanumihardjo rutynowo syntetyzuje octan 3,4-didehydroretynylu na potrzeby Centrów Kontroli Chorób w Atlancie w stanie Georgia w celu wykorzystania ich w ocenach żywienia populacji. W związku z tym nie przewidujemy problemu w wykorzystaniu bieżących zapasów rotacyjnych przechowywanych w temperaturze -80oC do proponowanej oceny poziomu witaminy A u niemowląt matek włączonych do badania kinetycznego. Publikowane są procedury syntetyczne stosowane wyłącznie w laboratorium Tanumihardjo (Barua i Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). W skrócie, kwas retinowy jest metylowany diazometanem. Powstały metyloretinoat utlenia się dwutlenkiem manganu, tworząc 4=oksometyloretynian. Po dokładnym oczyszczeniu i krystalizacji 4=okso redukuje się do 4-OH-metyloretynianu za pomocą borowodorku sodu. Po krystalizacji w heksanach w temperaturze -30oC przez kilka dni, 4-OH odwadnia się kwasem p-toluenosulfonowym, a powstały 3,4-didehydrometyloretynian oczyszcza się i pozostawia do krystalizacji przez noc. Na koniec 3,4-didehydro-metyloretinoat redukuje się do 3,4-didehydroretinolu za pomocą wodorku litowo-glinowego i natychmiast acetyluje do octanu 3,4-didehydroretinylu, oczyszcza, rozpuszcza w oleju sojowym i przechowuje w temperaturze -80oC do czasu przygotowania i dostosowania dawek na studia indywidualne.

III.6. Poświadczenie etyczne Protokoły i formularze świadomej zgody zostaną poddane ocenie etycznej w Instytucjonalnych Komisjach Rewizyjnych IRSS i zostaną zarejestrowane w Panafrykańskim Rejestrze Badań Klinicznych (www.pactr.org) bazy danych pod unikalnym numerem identyfikacyjnym. Mamy już doświadczenie w pracy z testem RID u dzieci (Bationo i in., 2019).

IV. Plan pracy w ramach badania Plan czasowy, IRSS Burkina Faso Działania Rok 1 Rok 2 Rok 3 Rok 4 I kwartał 2 kwartał 3 kwartał 4 kwartał 1 kwartał 2 kwartał 3 kwartał 4 kwartał 1 kwartał 2 kwartał 3 kwartał 4 kwartał 1 kwartał 2 kwartał 3 kwartał 4 Zakończenie protokołu Ocena etyczna i zatwierdzenie Opracowanie SOP Przygotowanie miejsca badania Wybór i szkolenie personelu badawczego Pierwsza runda pierwszego badania przekrojowego Przygotowanie i przechowywanie próbek Druga runda pierwszego badania przekrojowego Przygotowanie i przechowywanie próbek Wysyłka próbek Pierwsza runda drugiego badania przekrojowego Przygotowanie i przechowywanie próbek Druga runda drugiego badania przekrojowego Przygotowanie i przechowywanie próbek Wysyłka próbek Analiza laboratoryjna Obsługa danych Rozpowszechnianie, lokalne, krajowe, międzynarodowe