Validatie en vereenvoudiging van de retinol-isotopenverdunningstechniek bij Burkinese schoolkinderen (RID_VAB)

Projecttitel Validatie en vereenvoudiging van de retinol-isotoopverdunningstechniek bij Burkinese schoolkinderen

I. Achtergrond en rationele biomarkers voor de vitamine A-status die de gouden standaard weerspiegelen, dat wil zeggen leverbiopsie, zijn beschikbaar, maar worden verfijnd om de toegankelijkheid in populatiegebaseerde toepassingen te vergroten. Het testen van isotopenverdunning met retinol (RID) is zo'n biomarker. In Burkina Faso konden we een 7-daagse test evalueren met een 14-daagse test door simpelweg een correctiefactor aan de voorspellingsvergelijking toe te voegen. De waarden voor de totale vitamine A-voorraad in het lichaam waren vergelijkbaar, maar de variatie nam toe naarmate de leverreserves groter werden. De aanname van 3% van het lichaamsgewicht als levergewicht bij schoolgaande kinderen werd op passende wijze bevestigd bij de berekening van de totale vitamine A-reserves in de lever. Het vereenvoudigen van de isotopenverdunning voor bevolkingsevaluatie en het opbouwen van capaciteit voor massaspectrometrieanalyses zijn belangrijke gebieden van voedingsontwikkeling ter informatie van volksgezondheidsprogramma's. Dit voorstel zal de methode blijven verfijnen voor wijdverbreid gebruik.

II. Het algemene doel Het verschaffen van nieuwe kennis over het gebruik van de isotopenverdunningstechniek van retinol in grotere bevolkingsonderzoeken om de vitamine A-status te beoordelen van tekort naar overmaat.

II.1. Specifieke doelstellingen Voor dit CRP zijn een aantal specifieke doelstellingen geschetst. Via het onderzoek dat in Burkina Faso zal worden uitgevoerd en op bestaande datasets zullen we ons richten op de volgende specifieke doelstellingen bij schoolkinderen.

1. Het definiëren van een overtollige totale leverreservewaarde voor vitamine A door nuchtere serumretinylestergegevens toe te passen bij schoolkinderen met de RID-test. 2. Onderzoeken hoe de bestaande methodologie kan worden vereenvoudigd om aan te sluiten bij bevolkingsonderzoeken zonder verlies van nauwkeurigheid, met behulp van retinolzuiveringstechnieken ter plaatse 3. Onderzoeken hoe de retinol-isotoopverdunningstechniek wordt beïnvloed door ontstekingen op het moment van toediening, met behulp van een bestaande dataset bij Afrikaanse kleuters. 4. Onderzoeken van het verschil in absorptie van 3,4-didehydroretinylacetaat uit olie en in ingekapselde vorm bij schoolgaande kinderen.

III. Methode III.1. Studielocatie en populatie Het voorgestelde onderzoek zal worden uitgevoerd in een basisschool in het westelijke deel van Burkina Faso, in Orodara, een dorp aan de buitenrand van Bobo Dioulasso, waar we ons zullen richten op kinderen van 7 tot 12 jaar. De meeste inwoners van het dorp zijn boeren met een middeninkomen en hun gezinnen. Burkina Faso is een van de landen die betrokken zijn bij het consortium VITAAFRO (Vitamine A in Afrika) dat geïnteresseerd is in het nauwkeurig bepalen van de VA-status om bestaande interventies en beleid te informeren.

III.2. Studieontwerp Gedurende een schooljaar worden twee opeenvolgende cross-sectionele onderzoeken uitgevoerd. Het eerste onderzoek aan het begin van het schooljaar, wat toevallig het einde van het regenseizoen is, en dat ook buiten het mangoseizoen valt, en het tweede onderzoek, 5 tot 6 maanden later, na de eerste reeks gegevensverzameling. tijdens het mangoseizoen zullen deze onderzoeken worden uitgevoerd op een basisschool in het westelijke deel van Burkina Faso, in Orodara, een dorp aan de buitenrand van Bobo Dioulasso.

III.3. Bemonsteringsmethode In totaal zullen 158 schoolkinderen op twee verschillende manieren worden gerekruteerd. In eerste instantie zal een groep van 60 schoolkinderen worden gerekruteerd via een gestratificeerde steekproef, inclusief kinderen van het eerste tot het laatste schooljaar van het basisonderwijs en proportioneel aan hun aantal per klas. Bij deze eerste groep van 60 schoolkinderen zal een retinol-isotopenverdunningstest (RID) voor de beoordeling van de totale lichaamsvoorraad worden toegepast om de waarden te vergelijken met nuchtere serum-retinylesterconcentraties bij aanvang.

De resterende 98 schoolkinderen zullen worden gerekruteerd volgens gestratificeerde steekproeven en proportioneel aan hun aantal per klas en verdeeld in twee groepen van 49 kinderen op basis van het geslacht (d.w.z. 49 vrouwen en 49 mannen). Bij elke deelnemer worden twee tijdstippen voor bloedafname uitgevoerd. De deelnemer wordt vervolgens willekeurig toegewezen aan de bloedafname op H0, H2, H3, H4, H5, H6, H8, H10, H24, H72, H168 en H336, zoals hieronder aangegeven. Er wordt een randomisatielijst gegenereerd met behulp van tabellen met willekeurige getallen. We hebben ervoor gekozen om blok-randomisatie toe te passen in plaats van eenvoudige randomisatie, omdat de eerstgenoemde aanpak ons ​​in staat zal stellen onbevooroordeelde vergelijkingsgroepen te hebben die gedurende de hele proef ongeveer even groot zullen zijn. Door gebruik te maken van blokrandomisatie zullen er altijd vrijwel gelijke aantallen kinderen in elke onderzoeksgroep zijn.

Voor deze groepen kinderen zal de gemodificeerde relatieve dosis-respons (MRDR)-test, een kwalitatieve maatstaf voor de vitamine A-status, worden gebruikt om de absorptie van 3,4-didehydroretinylacetaat te onderzoeken.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Bewustwording en sensibilisering van de gemeenschap Voordat we met het onderzoek beginnen, zullen we een reeks bijeenkomsten houden met belangrijke besluitvormers en gemeenschapsleiders in het studiegebied als onderdeel van de inspanningen om het bewustzijn te vergroten en de gemeenschap voor het onderzoek te mobiliseren. Deze community outreach- en sensibiliseringsbijeenkomsten zullen de gemeenschap informeren over het bestaan ​​en het doel van het onderzoek, evenals over de voordelen, niet alleen voor hun gemeenschappen, maar ook voor het land en Afrika in het algemeen. Voor elk van de mensstudies zullen de redenen voor de keuze van het gebied en de voorgestelde opzet worden uitgelegd.

III.5. Werving en screening

Als screeningsproces wordt een lijst gemaakt van de in aanmerking komende schoolkinderen waaruit de selectie zal worden uitgevoerd. Kinderen komen in aanmerking voor deelname als ze aan de volgende screeningcriteria voldoen:

III.5.1. Inclusiecriteria:

• Schoolkinderen van 7 tot 12 jaar
• De voogd of ouder van het kind is bereid geïnformeerde toestemming te geven
• De familie van het kind is van plan om tijdens de onderzoeksperiode in de studiegebieden te blijven wonen

III.5.2. Uitsluitingscriteria:

• Klinisch bewijs van vitamine A-tekort mis en forme: Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme: Anglais (États-Unis)a mis en forme: Anglais (États-Unis)a mis en forme: Anglais (États-Unis)
• Ernstige ondervoeding (gewicht naar leeftijd Z-score (WAZ) of lengte naar leeftijd Z-score (HAZ) <-3 SD)
• Ernstige ziekten, waaronder tuberculose, symptomatische HIV-infectie
• Kind <6 jaar of >12 jaar III.6. Onderzoeksvariabelen Na screening op geschiktheid wordt geïnformeerde toestemming verkregen van het kind en zijn verzorger of ouder. We zullen sociaal-economische informatie verzamelen (bijv. inkomen, opleiding, gezinsvermogen) en antropometrische metingen uitvoeren (gewicht, lengte), beoordeling van de hemoglobinestatus, en dikke en dunne bloeduitstrijkjes maken voor malariadetectie. Er wordt een ontlastingsmonster verzameld voor de bepaling van darmparasieten.

III.7. Verwerking van bloedmonsters Voor de 60 kinderen die betrokken zijn bij de totale lichaamsopslaganalyse richten we ons op kinderen van 7 tot 12 jaar en worden basiskenmerken van de proefpersonen verkregen. Bij aanvang wordt bij elk kind een nuchter veneus bloedmonster (7 ml) afgenomen. Daarna zullen ze een orale dosis van 1,0 μmol [14,15]-13C2-retinylacetaat krijgen, die zal worden gesynthetiseerd zoals gepubliceerd (Tanumihardjo, 2001), opgelost in sojaolie, en toegediend met een positieve verplaatsingspipet van 250 microL. De dosis wordt onmiddellijk gevolgd door een theelepel olijfolie om de opname te bevorderen. Kinderen krijgen een gestandaardiseerd ontbijt met witbrood en hazelnootpasta met chocoladesmaak. Het vervolgbloed wordt op dag 14 na de dosis verzameld door de verpleegkundigen van de Orodara-kliniek, onmiddellijk op ijs bewaard en voor verwerking naar het Institut de Recherche en Sciences de la Santé in Bobo-Dioulasso getransporteerd.

De serummonsters van dezelfde groep van 60 schoolkinderen worden in drie buizen verdeeld en ingevroren bij -80 graden Celsius.

Alle monsters worden verzonden of met de hand vervoerd naar de Universiteit van Wisconsin-Madison (UW) voor analyse door middel van gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding massaspectrometrie (GCCIRMS), zoals hieronder beschreven.

De basisbloedmonsters zullen ook worden geanalyseerd op serumretinylesters en carotenoïden, zoals hieronder beschreven voor lage monstervolumes.

Een soortgelijke methode is in het verleden in Burkina Faso gebruikt (Bationo et al., 2018), waarbij een lage groente-inname aan het licht kwam. Sinds dat onderzoek is echter met vitamine A verrijkte olie algemeen verkrijgbaar in het land. Deze studie zal waarde toevoegen aan de validatie van serumretinylesters als maatstaf voor vitamine A-overmaat.

Een voorzuivering van retinol uit serum zal worden onderzocht met behulp van vaste-fase-extractie (SPE)-methoden met conserveermiddel uit één aliquot om de extra regeldruk van het verzenden van menselijke biologische monsters (serum) te vermijden. We zullen eerst optimale protocollen bepalen aan de Universiteit van Wisconsin - Madison. Pilotstudies hebben gesuggereerd dat voorwaartse fase SPE met behulp van NH2-kolommen en hexaan/ethylacetaatoplosmiddelen een zeer hoge terugwinning en zuiverheid van retinol uit serum hebben, en we zullen gebutyleerd hydroxytolueen en alfa-tocoferol als conserveermiddelen onderzoeken. Als SPE-voorzuivering in het veld wordt gebruikt, zijn we van plan het retinol opnieuw te zuiveren door HPLC voordat het in GCCIRMS wordt geïntroduceerd, zodat we zullen bepalen welk conserveermiddel de HPLC-herzuivering en analyse niet zal verstoren.

Een bestaande dataset bij Afrikaanse kleuters van 3 tot 4 jaar oud, om te onderzoeken hoe de RID-techniek wordt beïnvloed door ontstekingen op het moment van dosering. Het is bekend dat serumretinol en retinolbindend eiwit tijdelijk worden verminderd door ontstekingen (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Dit kan van invloed zijn op de schattingen van de vitamine A-status in populaties met hoge niveaus van klinische of subklinische infecties (Suri et al., 2015; 2021). Het potentiële effect van ontsteking op RID is echter niet geëvalueerd bij een grote groep kinderen. We hebben de totale vitamine A-voorraad in het lichaam berekend bij kinderen uit Burkina Faso, Ethiopië, Kameroen, Zuid-Afrika en Tanzania. De ontstekingsstatus is beoordeeld door het meten van C-reactief proteïne (CRP) en alfa1-zuur-glycoproteïne (AGP) verkregen uit de bloedmonsters op het moment van dosering. We zullen kijken naar de associatie tussen totale leverreserves (TLR) op basis van de 13C-RID-test en continue waarden van CRP en AGP, waarbij we testen of de helling van de relatie niet gelijk is aan nul. We zullen ook categorische gemiddelden voor TLR vergelijken met behulp van de volgende vier ontstekingscategorieën: geen ontsteking, incubatie (alleen verhoogde CRP (>5 mg/l)), vroege herstel (verhoogde CRP en AGP (>1 g/l)), en laat herstel (alleen verhoogde AGP) met behulp van een ANOVA-test voor verschillen tussen groepen.

Voor het tweede cross-sectionele onderzoek met MRDR-testen zullen we ons nog steeds richten op kinderen van 7 tot 12 jaar en zullen basiskenmerken van de proefpersonen worden verkregen om de absorptiecurven te evalueren met behulp van een analoog en om te bepalen of er een verschil is met behulp van capsules in de absorptiecurven.

Deze studie zal de absorptie van 3,4-didehydroretinylacetaat onderzoeken als analogie met gelabeld retinylacetaat in capsules versus directe orale doses in olie. Met behulp van dezelfde bewustwordings- en sensibilisatieprocedures als hierboven vermeld, worden kinderen verdeeld in zes groepen van 15 en willekeurig toegewezen aan capsuletoediening of directe orale dosis met verschillende tijdstippen waarop bloedmonsters worden afgenomen, van 0 tot 7 uur later. Alle monsters zullen worden geanalyseerd op 3,4-didehydroretinol en 3,4-didehydroretinylesters. De alcoholvorm zal gelijk zijn aan de vorm die gebonden is aan retinolbindend eiwit (RBP), terwijl de esters de absorptiecurven zullen weerspiegelen.

Alle kinderen krijgen 7,0 μmol 3,4-didehydroretinylacetaat opgelost in ongeveer 200 μl sojaolie. De grenswaarde voor vitamine A-tekort voor de MRDR-test is 0,060, wat de verhouding 3,4-didehydroretinol tot retinol is 4 tot 6 uur na toediening. Daarom zal elk kind deze meting ondergaan. Het gebied onder de esterabsorptiecurve van 2 tot 5 uur zal de chylomicronverdeling van de orale dosis onthullen. Alle monsters zullen worden geanalyseerd met behulp van de standaardmethode van 250 μl voor de MRDR en een uitgebreide UPLC-methode voor 3,4-didehydroretinol- en 3,4-didehydroretinylesters.

Het onderzoek zal twee fasen kennen:

Een eerste fase zal worden uitgevoerd na het mangoseizoen (november-december) en een tweede fase van het onderzoek zal worden uitgevoerd tijdens het mangoseizoen (april-mei).

III.8. Laboratoriumanalyse

Analyse van monsters met behulp van gaschromatografie-verbranding-isotoopverhouding massaspectrometrie (GCCIRMS):

Serum: Serumextractieprocedures en instrumentatie voor GCCIRMS-analyse zijn eerder gerapporteerd (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Kortom, serum ontdooid bij kamertemperatuur. Aan 0,75 ml (of al het beschikbare) serum wordt ethanol (1 x vol) toegevoegd om eiwitten neer te slaan, C23-bèta-apo-carotenol wordt toegevoegd als interne standaard en er worden 3 x 1 ml hexaanextracties uitgevoerd. Hexanen worden samengevoegd, onder stikstof gedroogd, opnieuw gesuspendeerd in 100 μl methanol, gedurende ~5 minuten bevroren bij -80⁰C, kort gecentrifugeerd en geïnjecteerd op HPLC-systeem 1 voor kwantificering en zuivering. Systeem 1 is een Gracesmart C18-kolom (5 μm, 4,6 x 250 mm) met 92:8 acetonitril:water bij 1,0 ml/min. De retinolfractie werd verzameld, gedroogd onder stikstof en opnieuw gesuspendeerd in 100 μl methanol voor injectie in systeem 2. Systeem 2 is een identieke kolom met 100% methanol bij 0,7 ml/min. De retinolfractie wordt verzameld, onder vacuüm gedroogd met een SPD1010 SpeedVac, opnieuw gesuspendeerd in 4-6 μl hexaan en 1-3 μl geïnjecteerd (om ongeveer 75 ng te injecteren) op de GC. Het GC/C/IRMS-systeem werd gepubliceerd (Howe et al., 2009). Atoom% (At%) wordt rechtstreeks berekend (Isodat versie 2.0) met betrekking tot koolstofdioxide, dat is gekalibreerd tegen een sucrosestandaard (NIST, 8542).

Retinylester- en carotenoïdenanalyse: Serumcarotenoïden en retinylesters zullen worden geanalyseerd zoals gepubliceerd (Williams et al., 2021) aan het laboratorium van de University of Wisconsin-Madison Department of Nutritional Sciences door middel van ultra-performance vloeistofchromatografie (Waters UPLC®) volgens een eerder beschreven oplosmiddelsysteem (Gannon et al., 2018), geoptimaliseerd voor lage monstervolumes en gewenste analyten. In het kort wordt 150 μl serum, of alles wat beschikbaar is, verdeeld in borosilicaatglasbuizen (Fisher Scientific) waaraan 100 μl C-23 β-apo-carotenol (interne standaard optische dichtheid in methanol ~1,0 bij 325 nm) en 225 μl ethanol worden toegevoegd. toegevoegd. Organische verbindingen worden driemaal geëxtraheerd met 500 μl hexanen, gemengd met een vortex en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij een relatieve centrifugaalkracht van 1200 zwaartekrachteenheden. Gepoolde hexaanlagen worden gedroogd in glazen buizen met conische bodem onder een stroom stikstof. Het gedroogde extract wordt opnieuw gesuspendeerd in 75 μl van een methanol:dichloorethaan-concentratie van 75:25, overgebracht naar UPLC-flesjes (Waters) en 6 μl geïnjecteerd in het UPLC-systeem.

III.9. Organische synthese voor voltooiing van het project. Synthese van 13C-retinylacetaat voor voltooiing van doelstellingen 1 en 2. 13C2-retinylacetaat zal worden gesynthetiseerd met behulp van een procedure die in detail is gepubliceerd door Tanumihardjo (2001). In het kort wordt C18-tetraeenketon gesynthetiseerd uit β-ionon, een in de handel verkrijgbare precursor, en zorgvuldig gezuiverd. Met behulp van een gemodificeerde Whittig-Horner-procedure wordt C-18-tetraeenketon in reactie gebracht met het carbanion van 13C2-gelabeld triethylfosfonoacetaat om 2-13C's toe te voegen aan de ruggengraat van de retinolgroep. De resulterende ethylester wordt gereduceerd tot de alcohol en veresterd tot 13C2-retinylacetaat met azijnzuuranhydride. Het synthetische all-trans-isomeer wordt zorgvuldig gezuiverd op 8% water-gedeactiveerd aluminiumoxide met behulp van relatief onschadelijke, zeer vluchtige, organische oplosmiddelen, bijvoorbeeld hexanen en diethylether. Het resulterende preparaat wordt gekarakteriseerd met behulp van UV-VIS-spectroscopie, TLC en HPLC. Voor langdurige opslag wordt het 14,15-13C2-retinylacetaat opgelost in sojaolie bij -80oC bewaard. We zullen de laatste doses kort voor het onderzoek bereiden in sojaolie (~200 μl/dosis) en deze met de hand naar elke onderzoekslocatie brengen.

Synthese van 3,4-didehydroretinylacetaat ter voltooiing van Doelstelling 4: Dr. Tanumihardjo synthetiseert routinematig 3,4-didehydroretinylacetaat voor de Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, om te gebruiken in hun populatiegebaseerde voedingsevaluaties. Daarom voorzien we geen probleem bij het gebruik van de huidige roterende voorraden die bij -80oC zijn opgeslagen voor de voorgestelde evaluatie van de vitamine A-status bij de zuigelingen van de moeders die deelnamen aan het kinetische onderzoek. De synthetische procedures die uitsluitend in het Tanumihardjo-laboratorium worden gebruikt, zijn gepubliceerd (Barua en Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). In het kort wordt retinoïnezuur gemethyleerd met diazomethaan. Het resulterende methylretinoaat wordt geoxideerd met mangaandioxide om 4=oxo-methylretinoaat te vormen. Na zorgvuldige zuivering en kristallisatie wordt het 4=oxo met behulp van natriumboorhydride gereduceerd tot 4-OH-methylretinoaat. Na kristallisatie in hexanen bij -30oC gedurende enkele dagen wordt 4-OH gedehydrateerd met p-tolueensulfonzuur en wordt het resulterende 3,4-didehydromethylretinoaat gezuiverd en gedurende de nacht gekristalliseerd. Ten slotte wordt 3,4-didehydro-methylretinoaat gereduceerd tot 3,4-didehydroretinol met lithiumaluminiumhydride en onmiddellijk geacetyleerd tot 3,4-didehydroretinylacetaat, gezuiverd, opgelost in sojaolie en bewaard bij -80oC totdat de doses zijn bereid en aangepast. voor individuele studies.

III.6. Ethische goedkeuring De protocollen en formulieren voor geïnformeerde toestemming zullen een ethische beoordeling ondergaan in de Institutional Review Boards van IRSS en zullen worden geregistreerd bij Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org) database onder een uniek identificatienummer. We hebben al ervaring met het werken met de RID-test bij kinderen (Bationo et al., 2019).

IV. Studiewerkplan Tijdplan, IRSS Burkina Faso Activiteiten Jaar 1 Jaar 2 Jaar 3 Jaar 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Afronding van het protocol Ethische beoordeling en goedkeuring Ontwikkeling van SOP's Voorbereiding van de studielocatie Selectie en training van studiepersoneel Eerste ronde van het eerste cross-sectionele onderzoek Monstervoorbereiding en opslag Tweede ronde van het eerste cross-sectionele onderzoek Monstervoorbereiding en opslag Monsterverzending Eerste ronde van de tweede cross-sectioneel onderzoek Monstervoorbereiding en opslag Tweede ronde van het tweede cross-sectioneel onderzoek Monstervoorbereiding en opslag Monsterverzending Laboratorium geanalyseerd Gegevensverwerking Verspreiding, lokaal, nationaal, internationaal