Validação e simplificação da técnica de diluição de isótopos de retinol em escolares burquinenses (RID_VAB)

Título do projeto Validação e simplificação da técnica de diluição de isótopos de retinol em escolares burquinenses

I. Antecedentes e racionais Biomarcadores do status de vitamina A que refletem o padrão-ouro, ou seja, biópsia hepática, estão disponíveis, mas estão sendo refinados para aumentar a acessibilidade em aplicações populacionais. O teste de diluição de isótopos de retinol (RID) é um desses biomarcadores. No Burkina Faso, conseguimos avaliar um teste de 7 dias com um teste de 14 dias com a simples adição de um factor de correcção à equação de previsão. Os valores das reservas totais de vitamina A no corpo foram semelhantes, mas a variação aumentou com o aumento das reservas hepáticas. A suposição de 3% do peso corporal como peso do fígado em crianças em idade escolar foi confirmada como apropriada no cálculo das reservas totais de vitamina A do fígado. A simplificação da diluição de isótopos para avaliação da população e o reforço da capacidade para análises por espectrometria de massa são áreas importantes do desenvolvimento da nutrição para informar os programas de saúde pública. Esta proposta continuará a refinar o método para uso generalizado.

II. O objetivo geral Fornecer novos conhecimentos sobre como usar a técnica de diluição de isótopos de retinol em pesquisas populacionais maiores para avaliar o status da vitamina A, desde a deficiência até o excesso.

II.1. Objectivos específicos Foram delineados vários objectivos específicos para este CRP. Através da investigação que será realizada no Burkina Faso e nos conjuntos de dados existentes, iremos concentrar-nos nos seguintes objectivos específicos em crianças em idade escolar.

1. Definir um valor de reserva hepática total com excesso de vitamina A aplicando dados de éster de retinil sérico em jejum em crianças em idade escolar com teste RID 2. Examinar como a metodologia existente pode ser simplificada para se adequar a pesquisas populacionais sem perda de precisão, usando técnicas de purificação de retinol no local 3. Explorar como a técnica de diluição de isótopos de retinol é afetada pela inflamação no momento da dosagem, utilizando um conjunto de dados existente em crianças pré-escolares africanas. 4. Examinar a diferença na absorção de Acetato de 3,4-didesidroretinila a partir de óleo e na forma encapsulada em crianças em idade escolar.

III. Método III.1. Local de estudo e população O estudo proposto será realizado numa escola primária na parte ocidental do Burkina Faso, em Orodara, uma aldeia na periferia de Bobo Dioulasso, onde teremos como alvo crianças dos 7 aos 12 anos. A maioria dos habitantes da aldeia são agricultores de rendimento médio e suas famílias. O Burkina Faso é um dos países envolvidos no consórcio VITAAFRO (Vitamina A em África) que está interessado em determinar com precisão o estatuto de VA para informar as intervenções e políticas existentes.

III.2. Desenho do estudo Dois estudos transversais sucessivos serão realizados durante um ano letivo. O primeiro estudo no início do ano letivo, que acontece no final da estação chuvosa, e que também está fora da estação das mangas e o segundo estudo, 5 a 6 meses depois, após o primeiro conjunto de coleta de dados, durante a época das mangas, estes estudos serão realizados numa escola primária na parte ocidental do Burkina Faso, em Orodara, uma aldeia na periferia de Bobo Dioulasso.

III.3. Método de amostragem No total, 158 crianças em idade escolar serão recrutadas de duas maneiras diferentes. Num primeiro momento, será recrutado um grupo de 60 crianças em idade escolar através de uma amostragem estratificada incluindo crianças do primeiro ao último ano do ensino primário e proporcionalmente ao seu número por turma. Para este primeiro grupo de 60 crianças em idade escolar, um teste de diluição de isótopos de retinol (RID) para avaliação do armazenamento corporal total será aplicado para comparar os valores com as concentrações séricas de éster de retinil em jejum no início do estudo.

As restantes 98 crianças em idade escolar serão recrutadas de acordo com uma amostragem estratificada e proporcionalmente ao seu número por turma e divididas em dois grupos de 49 crianças de acordo com o sexo (ou seja, 49 mulheres e 49 homens). Em cada participante, serão realizados dois momentos de coleta de sangue. O participante será então designado aleatoriamente para coletar amostras de sangue em H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 e H336 conforme especificado abaixo. Uma lista de randomização será gerada usando tabelas de números aleatórios. Optamos por fazer a randomização em bloco em vez da simples porque a primeira abordagem nos permitirá ter grupos de comparação imparciais que terão aproximadamente o mesmo tamanho durante todo o ensaio. Ao usar a randomização em bloco, sempre haverá um número quase igual de crianças em cada grupo de estudo.

Para esses grupos de crianças, o teste de resposta à dose relativa modificada (MRDR), uma medida qualitativa do status de vitamina A, será usada para investigar a absorção de acetato de 3,4-didesidroretinila.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Conscientização e sensibilização da comunidade Antes do início do estudo, realizaremos uma série de reuniões com os principais tomadores de decisão e líderes comunitários na área de estudo, como parte dos esforços para aumentar a conscientização e mobilizar a comunidade para o estudo. Estas reuniões de divulgação e sensibilização comunitárias informarão a comunidade sobre a existência e o objectivo do estudo, bem como os benefícios não só para as suas comunidades, mas também para o país e para África em geral. Serão explicados os motivos da escolha da área para cada um dos estudos em humanos e do desenho proposto.

III.5. Recrutamento e triagem

Como processo de triagem, será feita uma lista dos escolares elegíveis a partir da qual será realizada a seleção. As crianças serão elegíveis para participar se atenderem aos seguintes critérios de triagem:

III.5.1. Critérios de inclusão:

• Crianças em idade escolar de 7 a 12 anos
• O responsável ou pai da criança está disposto a fornecer consentimento informado
• A família da criança planeja permanecer residente nas áreas de estudo durante o período de estudo

III.5.2. Critérios de exclusão:

• Evidência clínica de deficiência de vitamina A a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Desnutrição grave (escore Z de peso para idade (WAZ) ou escore Z de altura para idade (HAZ) <-3 DP)
• Doenças graves, incluindo tuberculose, infecção sintomática por HIV
• Criança com idade <6 anos ou >12 anos III.6. Variáveis ​​do estudo Após a triagem de elegibilidade, o consentimento informado será obtido da criança e de seu cuidador ou pai. Coletaremos informações socioeconômicas (por ex. renda, escolaridade, bens familiares) e realizar medições antropométricas (peso, altura), avaliação do estado de hemoglobina e preparar esfregaços de sangue espessos e finos para detecção da malária. Uma amostra de fezes será coletada para determinação de parasitas intestinais.

III.7. Processamento de amostras de sangue Para as 60 crianças envolvidas na análise total do armazenamento corporal, teremos como alvo crianças de 7 a 12 anos e as características básicas do sujeito serão obtidas. No início do estudo, uma amostra de sangue venoso em jejum (7 mL) será coletada de cada criança. A partir daí, eles receberão uma dose oral de 1,0 μmol de [14,15]-13C2-acetato de retinila, que será sintetizado conforme publicado (Tanumihardjo, 2001), dissolvido em óleo de soja e administrado com uma pipeta de deslocamento positivo de 250 microL. A dose será imediatamente seguida por uma colher de chá de azeite para ajudar na absorção. As crianças comerão um café da manhã padronizado com pão branco e pasta de avelã com sabor de chocolate. O sangue de acompanhamento será coletado pelas enfermeiras da clínica de Orodara no dia 14 após a dose, armazenado imediatamente em gelo e transportado para o Institut de Recherche en Sciences de la Santé localizado em Bobo-Dioulasso para processamento.

As amostras de soro do mesmo grupo de 60 escolares serão alíquotas em três tubos e congeladas a -80 graus C.

Todas as amostras serão enviadas ou transportadas manualmente para a Universidade de Wisconsin-Madison (UW) para análise por espectrometria de massa de razão de cromatografia gasosa-combustão-isótopos (GCCIRMS), conforme descrito abaixo.

As amostras de sangue da linha de base também serão analisadas para ésteres de retinil e carotenóides séricos, conforme descrito abaixo para volumes baixos de amostras.

Um método semelhante foi utilizado no passado no Burkina Faso (Bationo et al., 2018), que revelou uma baixa ingestão de vegetais. No entanto, o óleo fortificado com vitamina A tornou-se amplamente disponível no país desde que o estudo foi realizado. Este estudo agregará valor à validação de ésteres retinílicos séricos como medida do excesso de vitamina A.

Uma pré-purificação do retinol do soro será investigada usando métodos de extração em fase sólida (SPE) com conservante de uma alíquota para evitar a carga regulatória extra de envio de amostras biológicas humanas (soro). Primeiro determinaremos os protocolos ideais na Universidade de Wisconsin - Madison. Estudos piloto sugeriram que a SPE de fase direta usando colunas de NH2 e solventes de hexano/acetato de etila apresentam recuperação e pureza muito altas de retinol do soro, e investigaremos o hidroxitolueno butilado e o alfa-tocoferol como conservantes. Se a pré-purificação por SPE for usada em campo, planejaremos repurificar o retinol por HPLC antes da introdução no GCCIRMS, portanto determinaremos qual conservante não interferirá na repurificação e análise por HPLC.

Um conjunto de dados existente em crianças pré-escolares africanas com idades entre os 3 e os 4 anos, para explorar como a técnica RID é afetada pela inflamação no momento da administração. É bem conhecido que o retinol sérico e a proteína de ligação ao retinol são temporariamente diminuídos pela inflamação (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Isto pode afectar as estimativas do estado da vitamina A em populações com níveis elevados de infecções clínicas ou subclínicas (Suri et al., 2015; 2021). No entanto, o efeito potencial da inflamação no RID não foi avaliado num grande grupo de crianças. Calculamos as reservas totais de vitamina A no corpo de crianças de Burkina Faso, Etiópia, Camarões, África do Sul e Tanzânia. O estado de inflamação foi avaliado medindo a proteína C reativa (PCR) e a alfa1-glicoproteína ácida (AGP) obtidas de amostras de sangue no momento da dosagem. Analisaremos a associação entre as reservas hepáticas totais (TLR) com base no teste 13C-RID e valores contínuos de PCR e AGP, testando se a inclinação da relação não é igual a zero. Também compararemos médias categóricas para TLR usando as seguintes quatro categorias de inflamação: sem inflamação, incubação (apenas PCR elevada (>5 mg/L)), convalescença precoce (PCR e AGP elevadas (>1 g/L)) e convalescença tardia (somente AGP elevado) usando um teste ANOVA para diferenças entre grupos.

Para o segundo estudo transversal envolvendo teste MRDR, ainda teremos como alvo crianças de 7 a 12 anos e as características basais dos sujeitos serão obtidas para avaliar curvas de absorção usando um análogo e para determinar se há diferença usando cápsulas nas curvas de absorção.

Este estudo investigará a absorção do acetato de 3,4-didesidroretinila como uma analogia ao acetato de retinila marcado em cápsulas versus doses orais diretas em óleo. Usando os mesmos procedimentos de conscientização e sensibilização mencionados acima, as crianças serão separadas em seis grupos de 15 e designadas aleatoriamente para administração de cápsulas ou dose oral direta com diferentes momentos de coleta de amostras de sangue, de 0 a 7 horas depois. Todas as amostras serão analisadas para ésteres de 3,4-didesidroretinol e 3,4-didesidroretinil. A forma alcoólica será igual àquela que está ligada à proteína de ligação ao retinol (RBP), enquanto os ésteres refletirão as curvas de absorção.

Todas as crianças receberão 7,0 μmol de acetato de 3, 4-didesidroretinila dissolvido em aproximadamente 200 μL de óleo de soja. O ponto de corte para deficiência de vitamina A para o teste MRDR é 0,060, que é a proporção de 3,4-didesidroretinol para retinol 4 a 6 horas após a administração. Portanto, cada criança terá essa medida. A área sob a curva de absorção do éster de 2 a 5 horas revelará a distribuição dos quilomícrons da dose oral. Todas as amostras serão analisadas usando o método padrão de 250 μL para o MRDR e um método UPLC estendido para 3,4-didesidroretinol e ésteres de 3,4-didesidroretinil.

O estudo terá duas fases:

Uma fase inicial será realizada após a época da manga (Novembro-Dezembro) e uma segunda fase do estudo será realizada durante a época da manga (Abril-Maio).

III.8. Análise laboratorial

Análise de amostras por espectrometria de massa de cromatografia gasosa-combustão-isótopo (GCCIRMS):

Soro: Os procedimentos de extração de soro e a instrumentação para análise do GCCIRMS foram relatados anteriormente (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Resumidamente, o soro foi descongelado à temperatura ambiente. A 0,75 mL (ou todos os disponíveis) de soro, adiciona-se etanol (1 x vol) para precipitar proteínas, adiciona-se beta-apo-carotenol C23 como padrão interno e são realizadas extrações com hexano 3 x 1 mL. Os hexanos são reunidos, secos sob nitrogênio, ressuspensos em 100 μL de metanol, congelados a -80⁰C por ~5 min, centrifugados brevemente e injetados no sistema HPLC 1 para quantificação e purificação. O sistema 1 é uma coluna Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) com acetonitrila:água 92:8 a 1,0 mL/min. A fração de retinol foi coletada, seca sob nitrogênio e ressuspensa em 100 μL de metanol para injeção no sistema 2. O sistema 2 é uma coluna idêntica com 100% de metanol a 0,7 mL/min. A fração de retinol é coletada, seca sob vácuo com um SPD1010 SpeedVac, ressuspensa em 4-6 μL de hexano e 1-3 μL injetados (para injetar aproximadamente 75 ng) no GC. O sistema GC/C/IRMS foi publicado (Howe et al., 2009). A % de átomos (At%) é calculada diretamente (Isodat versão 2.0) em referência ao dióxido de carbono, que é calibrado em relação a um padrão de sacarose (NIST, 8542).

Análise de éster retinílico e carotenóides: Os carotenóides séricos e ésteres retinílicos serão analisados ​​conforme publicado (Williams et al., 2021) no laboratório do Departamento de Ciências Nutricionais da Universidade de Wisconsin-Madison por cromatografia líquida de ultra-desempenho (Waters UPLC®) de acordo com um sistema de solvente descrito anteriormente (Gannon et al., 2018), otimizado para baixos volumes de amostra e analitos desejados. Resumidamente, 150 μL de soro, ou todos os disponíveis, são divididos em alíquotas em tubos de vidro de borosilicato (Fisher Scientific) aos quais 100 μL de C-23 β-apo-carotenol (densidade óptica padrão interno em metanol ~1,0 a 325 nm) e 225 μL de etanol são adicionado. Os compostos orgânicos são extraídos três vezes com 500 μL de hexanos, misturados com um vórtice e centrifugados a uma força centrífuga relativa de 1200 unidades de gravidade durante 5 min. As camadas de hexano reunidas são secas em tubos de vidro de fundo cônico sob uma corrente de nitrogênio. O extrato seco é ressuspenso em 75 μL de concentração de metanol: dicloroetano 75:25, transferido para frascos UPLC (Waters) e 6 μL injetados no sistema UPLC.

III.9. Síntese orgânica para conclusão do projeto. Síntese de acetato de 13C-retinila para conclusão dos Objetivos 1 e 2. O acetato de 13C2-retinila será sintetizado usando um procedimento que foi publicado em detalhes por Tanumihardjo (2001). Resumidamente, a cetona C18-tetraeno é sintetizada a partir de β-ionona, um precursor disponível comercialmente, e cuidadosamente purificada. Utilizando um procedimento de Whittig-Horner modificado, faz-se reagir tetraeno cetona C-18 com o carbanião de trietilfosfosponoacetato marcado com 13C2 para adicionar 2-13C à estrutura principal da porção retinol. O éster etílico resultante é reduzido ao álcool e esterificado a acetato de 13C2-retinila com anidrido acético. O isômero totalmente trans sintético é purificado cuidadosamente em alumina desativada com água a 8% usando solventes orgânicos relativamente inócuos e altamente voláteis, por exemplo, hexanos e éter dietílico. A preparação resultante é caracterizada utilizando espectroscopia UV-VIS, TLC e HPLC. Para armazenamento de longo prazo, o acetato de 14,15-13C2-retinila é armazenado dissolvido em óleo de soja a -80oC. Prepararemos as doses finais em óleo de soja (~200 μL/dose) pouco antes do estudo e as transportaremos manualmente para cada local de estudo.

Síntese de acetato de 3,4-didesidroretinila para conclusão do Objetivo 4: Dr. Tanumihardjo sintetiza rotineiramente acetato de 3,4-didesidroretinila para uso nos Centros de Controle de Doenças, Atlanta, Geórgia, em suas avaliações nutricionais de base populacional. Portanto, não prevemos um problema no uso de estoques rotativos atuais que estão armazenados a -80oC para a avaliação proposta do status de vitamina A nos bebês das mães inscritas no estudo cinético. Os procedimentos sintéticos utilizados exclusivamente no laboratório Tanumihardjo são publicados (Barua e Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Resumidamente, o ácido retinóico é metilado com diazometano. O metilretinoato resultante é oxidado com dióxido de manganês para formar 4=oxo metilretinoato. Após cuidadosa purificação e cristalização, o 4=oxo é reduzido a 4-OH metilretinoato usando borohidreto de sódio. Após cristalização em hexanos a -30oC durante vários dias, o 4-OH é desidratado com ácido p-tolueno sulfônico e o 3,4-didesidro-metilretinoato resultante é purificado e deixado cristalizar durante a noite. Finalmente, o 3,4-didesidrometilretinoato é reduzido a 3,4-didesidroretinol com hidreto de alumínio e lítio e imediatamente acetilado a acetato de 3,4-didesidroretinila, purificado, dissolvido em óleo de soja e armazenado a -80oC até que as doses sejam preparadas e personalizadas para estudos individuais.

III.6. Autorização ética Os protocolos e formulários de consentimento informado serão submetidos a revisão ética nos Conselhos de Revisão Institucional do IRSS e serão registados no Registo Pan-Africano de Ensaios Clínicos (www.pactr.org) banco de dados sob um número de identificação único. Já temos experiência em trabalhar com o teste RID em crianças (Bationo et al., 2019).

4. Plano de trabalho do estudo Plano de tempo, IRSS Burkina Faso Atividades Ano 1 Ano 2 Ano 3 Ano 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Finalização do protocolo Revisão ética e aprovação Desenvolvimento de POPs Preparação do local de estudo Seleção e treinamento da equipe de estudo Primeira rodada do primeiro estudo transversal Preparo e armazenamento de amostras Segunda rodada do primeiro estudo transversal Preparo e armazenamento de amostras Envio de amostras Primeira rodada do segundo estudo transversal Preparo e armazenamento de amostras Segunda rodada do segundo estudo transversal Preparo e armazenamento de amostras Envio de amostras Análise laboratorial Manuseio de dados Divulgações, locais, nacionais, internacionais