Retinoli-isotooppilaimennustekniikan validointi ja yksinkertaistaminen Burkinaben koululaisissa (RID_VAB)

Hankkeen nimi Retinoli-isotooppilaimennustekniikan validointi ja yksinkertaistaminen Burkinaben koululaisilla

I. Tausta ja rationaaliset A-vitamiinistatuksen biomarkkerit, jotka heijastavat kultastandardia, eli maksabiopsia, ovat saatavilla, mutta niitä parannetaan saatavuuden lisäämiseksi väestöpohjaisissa sovelluksissa. Retinoli-isotooppilaimennustestaus (RID) on yksi tällainen biomarkkeri. Burkina Fasossa pystyimme arvioimaan 7 päivän testin 14 päivän testillä lisäämällä yksinkertaisesti korjaustekijän ennusteyhtälöön. Kehon A-vitamiinivarastojen kokonaisarvot olivat samanlaiset, mutta vaihtelu lisääntyi maksavarantojen kasvaessa. Oletus 3 % kehon painosta maksan painona kouluikäisillä lapsilla vahvistettiin sopivaksi maksan A-vitamiinin kokonaisvarantojen laskennassa. Isotooppilaimennusten yksinkertaistaminen väestön arvioinnissa ja kapasiteetin rakentaminen massaspektrometrian analyyseihin ovat tärkeitä ravitsemuskehityksen aloja kansanterveysohjelmien tiedottamiseksi. Tällä ehdotuksella jatketaan menetelmän kehittämistä laajaa käyttöä varten.

II. Yleistavoite Tarjoaa uutta tietoa siitä, miten retinoli-isotooppilaimennustekniikkaa käytetään laajemmissa väestötutkimuksissa A-vitamiinin tilan arvioimiseksi puutteesta ylimäärään.

II.1. Erityistavoitteet Tälle CRP:lle on hahmoteltu useita erityistavoitteita. Burkina Fasossa tehtävän tutkimuksen ja olemassa olevien tietokokonaisuuksien avulla keskitymme seuraaviin erityistavoitteisiin koululaisten kohdalla.

1. Määritellä A-vitamiinin ylimääräinen maksan kokonaisvarastoarvo soveltamalla paastoseerumin retinyyliesteritietoja koululaisille RID-testillä. 2. Tutkia, kuinka olemassa olevaa metodologiaa voidaan yksinkertaistaa sopimaan väestötutkimuksiin ilman tarkkuuden menetystä käyttämällä paikan päällä olevia retinolipuhdistustekniikoita. 3. Tutkia, kuinka tulehdus vaikuttaa retinoli-isotooppilaimennustekniikkaan annosteluhetkellä käyttämällä olemassa olevaa tietosarjaa afrikkalaisista esikoululaisista 4. Tutkia eroa 3,4-didehydroretinyyliasetaatin imeytymisessä öljystä ja kapseloidussa muodossa kouluikäisillä lapsilla.

III. Menetelmä III.1. Tutkimuspaikka ja väestö Ehdotettu tutkimus suoritetaan Burkina Fason länsiosassa sijaitsevassa alakoulussa Orodarassa, kylässä Bobo Dioulasson ulkoreunassa. Kohteenamme ovat 7–12-vuotiaat lapset. Suurin osa kylän asukkaista on keskituloisia maanviljelijöitä perheineen. Burkina Faso on yksi maista, jotka osallistuvat VITAAFRO-konsortioon (A-vitamiini Afrikassa), joka on kiinnostunut määrittämään VA-statuksen tarkasti olemassa olevien interventioiden ja käytäntöjen perusteella.

III.2. Opintosuunnitelma Lukuvuoden aikana suoritetaan kaksi peräkkäistä poikkileikkaustutkimusta. Ensimmäinen tutkimus lukuvuoden alussa, joka sattuu olemaan sadekauden lopussa ja joka on myös mangokauden ulkopuolella, ja toinen tutkimus, 5-6 kuukautta myöhemmin, ensimmäisen tiedonkeruun jälkeen, mangokauden aikana nämä tutkimukset suoritetaan ala-asteella Burkina Fason länsiosassa, Orodarassa, kylässä Bobo Dioulasson ulkoreunassa.

III.3. Otantatapa Yhteensä 158 koululaista rekrytoidaan kahdella eri tavalla. Ensimmäisellä kerralla rekrytoidaan ositetulla otannalla 60 koululaisen ryhmä, joka sisältää lapset ensimmäisestä viimeiseen peruskouluvuoteen ja suhteessa heidän määrään luokkaa kohti. Tähän ensimmäiseen 60 koululaisen ryhmään sovelletaan retinoli-isotooppilaimennustestiä (RID) koko kehon varaston arvioimiseksi, jotta arvoja verrataan seerumin paastoretinyyliesteripitoisuuksiin lähtötilanteessa.

Loput 98 koululaista rekrytoidaan ositetun otannan perusteella ja suhteessa heidän lukumääräänsä luokkaa kohti ja jaetaan kahteen 49 lapsen ryhmään sukupuolen mukaan (ts. 49 naista ja 49 miestä). Jokaisella osallistujalla suoritetaan kaksi verinäytteenottoaikaa. Osallistuja määrätään sitten satunnaisesti ottamaan verinäytteitä kohdissa H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 ja H336 alla kuvatulla tavalla. Satunnaislukuluettelo luodaan käyttämällä satunnaislukutaulukoita. Olemme päättäneet tehdä blokkauksen yksinkertaisen satunnaistamisen sijaan, koska aiempi lähestymistapa mahdollistaa puolueettomia vertailuryhmiä, jotka ovat suunnilleen samankokoisia koko kokeen ajan. Lohkosatunnaistamista käyttämällä jokaisessa tutkimusryhmässä on aina lähes yhtä suuri määrä lapsia.

Näille lapsiryhmille 3,4-didehydroretinyyliasetaatin imeytymisen tutkimiseen käytetään muunnetun suhteellisen annosvasteen (MRDR) testiä, A-vitamiinistatuksen kvalitatiivista mittaa.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Yhteisön tietoisuus ja herkistäminen Ennen tutkimuksen aloittamista pidämme sarjan tapaamisia tutkimusalueen keskeisten päätöksentekijöiden ja yhteisön johtajien kanssa osana pyrkimyksiä lisätä tietoisuutta ja mobilisoida yhteisöä tutkimukseen. Nämä yhteisön tiedotus- ja herkistystapaamiset tiedottavat yhteisölle tutkimuksen olemassaolosta ja tarkoituksesta sekä hyödyistä paitsi heidän yhteisöilleen, myös koko maalle ja Afrikalle yleensä. Heille selitetään syyt alueen valinnalle jokaiselle ihmistutkimukselle ja ehdotettu suunnittelu.

III.5. Rekrytointi ja seulonta

Seulontaprosessina tehdään luettelo kelvollisista koululaisista, joista valinta suoritetaan. Lapset ovat oikeutettuja osallistumaan, jos he täyttävät seuraavat seulontakriteerit:

III.5.1. Sisällön kriteerit:

• Koululaiset 7-12 vuotiaat
• Lapsen huoltaja tai vanhempi on valmis antamaan tietoisen suostumuksen
• Lapsen perhe aikoo jäädä opiskelualueille asumaan opintojakson ajan

III.5.2. Poissulkemiskriteerit:

• Kliininen näyttö A-vitamiinin puutteesta väärässä muodossa : Anglais (Royaume-Uni) väärässä muodossa : Anglais (États-Unis) väärässä muodossa : Anglais (États-Unis) väärässä muodossa : Anglais (États-Unis)
• Vaikea aliravitsemus (paino-ikä-Z-pisteet (WAZ) tai pituus-ikä-Z-pisteet (HAZ) <-3 SD)
• Vakavat sairaudet, mukaan lukien tuberkuloosi, oireinen HIV-infektio
• Alle 6-vuotias tai >12-vuotias lapsi III.6. Tutkimusmuuttujat Kelpoisuusseulonnan jälkeen hankitaan tietoinen suostumus lapselta ja hänen huoltajaltaan tai vanhemmalta. Keräämme sosioekonomisia tietoja (esim. tulot, koulutus, perheen omaisuus) ja suorittaa antropometrisiä mittauksia (paino, pituus), hemoglobiinitilan arviointi sekä paksun ja ohuen verinäytteen valmistaminen malarian havaitsemista varten. Ulostenäyte kerätään suolistoloisten määritystä varten.

III.7. Verinäytteiden käsittely Koko kehon varastoanalyysiin osallistuvien 60 lapsen osalta kohdistamme 7–12-vuotiaat lapset, ja tutkittavien lähtötilanteen ominaisuudet saadaan. Lähtötilanteessa jokaisesta lapsesta otetaan paastolaskimoverinäyte (7 ml). Sen jälkeen heille annetaan suun kautta annos 1,0 μmol [14,15]-13C2-retinyyliasetaattia, joka syntetisoidaan julkaisun mukaisesti (Tanumihardjo, 2001), liuotetaan soijaöljyyn ja annetaan 250 mikrolitran positiivisella syrjäytyspipetillä. Annosta seuraa välittömästi yksi teelusikallinen oliiviöljyä imeytymisen edistämiseksi. Lapset syövät standardoidun aamiaisen, joka sisältää valkoista leipää ja suklaalla maustettua hasselpähkinätahnaa. Orodaran klinikan sairaanhoitajat keräävät seurantaveren 14. päivänä annoksen ottamisen jälkeen, varastoidaan välittömästi jäälle ja kuljetetaan Bobo-Dioulassossa sijaitsevaan Institut de Recherche en Sciences de la Santéen käsittelyä varten.

Saman 60 koululaisen ryhmän seeruminäytteet jaetaan kolmeen putkeen ja pakastetaan -80 asteeseen.

Kaikki näytteet lähetetään tai kuljetetaan käsin Wisconsin-Madisonin yliopistoon (UW) analysoitavaksi kaasukromatografia-poltto-isotooppisuhdemassaspektrometrialla (GCCIRMS) alla kuvatulla tavalla.

Perusverinäytteistä analysoidaan myös seerumin retinyyliesterit ja karotenoidit, kuten alla on kuvattu pienille näytetilavuuksille.

Samanlaista menetelmää on käytetty aiemmin Burkina Fasossa (Bationo et al., 2018), mikä paljasti vähäisen vihannesten syönnin. Kuitenkin A-vitamiinilla väkevöity öljy on nyt tullut laajalti saataville maassa sen tutkimuksen jälkeen. Tämä tutkimus lisää arvoa seerumin retinyyliesterien validointiin A-vitamiinin ylimäärän mittana.

Retinolin esipuhdistusta seerumista tutkitaan käyttämällä kiinteän faasin uuttomenetelmiä (SPE) säilöntäaineella yhdestä erästä, jotta vältetään ihmisen biologisten näytteiden (seerumin) kuljettamisesta aiheutuva ylimääräinen sääntelytaakka. Ensin määritämme optimaaliset protokollat ​​Wisconsinin yliopistossa Madisonissa. Pilottitutkimukset ovat ehdottaneet, että eteenpäin suuntautuvan vaiheen SPE:llä, jossa käytetään NH2-kolonneja ja heksaani/etyyliasetaattiliuottimia, on erittäin korkea retinolin saanto ja puhtaus seerumista, ja aiomme tutkia butyloitua hydroksitolueenia ja alfa-tokoferolia säilöntäaineina. Jos SPE-esipuhdistusta käytetään kentällä, aiomme puhdistaa retinolin uudelleen HPLC:llä ennen sen lisäämistä GCCIRMS:ään, joten määritämme, mikä säilöntäaine ei häiritse HPLC-uudelleenpuhdistusta ja -analyysiä.

Olemassa oleva tietojoukko afrikkalaisista esikoululaisista 3–4-vuotiaista, jotta voidaan selvittää, kuinka tulehdus vaikuttaa RID-tekniikkaan annosteluhetkellä. On hyvin tunnettua, että seerumin retinoli ja retinolia sitova proteiini vähenevät väliaikaisesti tulehduksen takia (Filteau et ai., 1993; Thurnham et ai., 2003). Tämä voi vaikuttaa arvioihin A-vitamiinin tilasta populaatioissa, joilla on korkea kliinisten tai subkliinisten infektioiden taso (Suri et al., 2015; 2021). Tulehduksen mahdollista vaikutusta RID:iin ei kuitenkaan ole arvioitu suuressa ryhmässä lapsia. Olemme laskeneet Burkina Fasosta, Etiopiasta, Kamerunista, Etelä-Afrikasta ja Tansaniasta kotoisin olevien lasten A-vitamiinivarastot. Tulehdustila on arvioitu mittaamalla C-reaktiivinen proteiini (CRP) ja alfa1-happoglykoproteiini (AGP), jotka on saatu verinäytteistä annosteluhetkellä. Tarkastellaan 13C-RID-testiin perustuvaa kokonaismaksavarantojen (TLR) yhteyttä CRP:n ja AGP:n jatkuviin arvoihin ja testataan, onko suhteen kaltevuus nolla. Vertailemme myös TLR:n kategorisia keskiarvoja käyttämällä seuraavia neljää tulehdusluokkaa: ei tulehdusta, inkubaatio (vain kohonnut CRP (>5 mg/l)), varhainen toipuminen (kohonnut CRP ja AGP (>1 g/l)) ja myöhäinen toipuminen (vain kohonnut AGP) käyttämällä ANOVA-testiä ryhmien välisten erojen selvittämiseksi.

Toisessa poikkileikkaustutkimuksessa, johon sisältyy MRDR-testi, kohdennetaan edelleen 7–12-vuotiaisiin lapsiin, ja koehenkilöiden lähtötilanteen ominaisuudet hankitaan, jotta voidaan arvioida absorptiokäyriä analogin avulla ja määrittää, onko absorptiokäyrissä eroja käyttämällä kapseleita.

Tämä tutkimus tutkii 3,4-didehydroretinyyliasetaatin imeytymistä analogisesti leimatun retinyyliasetaatin kanssa kapseleissa verrattuna suoriin oraalisiin annoksiin öljyssä. Käyttämällä samoja tietoisuus- ja herkistysmenetelmiä kuin yllä mainittiin, lapset jaetaan kuuteen 15 hengen ryhmään ja jaetaan satunnaisesti kapseliin tai suoraan suun kautta annettavaan annokseen, jolloin verinäytteitä otetaan eri ajankohtina 0–7 tuntia myöhemmin. Kaikista näytteistä analysoidaan 3,4-didehydroretinoli ja 3,4-didehydroretinyyliesterit. Alkoholimuoto vastaa sitä, joka on sitoutunut retinolia sitovaan proteiiniin (RBP), kun taas esterit heijastavat absorptiokäyriä.

Kaikki lapset saavat 7,0 μmoolia 3, 4-didehydroretinyyliasetaattia liuotettuna noin 200 μl:aan soijaöljyä. A-vitamiinin puutteen raja-arvo MRDR-testissä on 0,060, joka on 3,4-didehydroretinolin ja retinolin välinen suhde 4-6 tunnin kuluttua annostelusta. Siksi jokaisella lapsella on tämä mittaus. Esterin absorptiokäyrän alla oleva pinta-ala 2–5 tuntia paljastaa kylomikronien jakautumisen suun kautta annetusta annoksesta. Kaikki näytteet analysoidaan MRDR:n tavanomaisella 250 µl-menetelmällä ja 3,4-didehydroretinolin ja 3,4-didehydroretinyyliestereiden laajennetulla UPLC-menetelmällä.

Tutkimuksessa on kaksi vaihetta:

Ensimmäinen vaihe toteutetaan mangokauden jälkeen (marraskuu-joulukuu) ja toinen vaihe mangokauden aikana (huhti-toukokuu).

III.8. Laboratorioanalyysi

Näytteiden analyysi kaasukromatografia-poltto-isotooppisuhdemassaspektrometrialla (GCCIRMS):

Seerumi: Seerumin uuttomenetelmistä ja instrumenteista GCCIRMS-analyysiä varten on raportoitu aiemmin (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Lyhyesti sanottuna seerumi on sulatettu huoneenlämmössä. 0,75 ml:aan (tai kaikkeen saatavilla olevaan) seerumiin lisätään etanolia (1 x tilavuus) proteiinien saostamiseksi, C23-beeta-apo-karotenolia lisätään sisäisenä standardina ja suoritetaan 3 x 1 ml:n heksaaniuuttoja. Heksaanit yhdistetään, kuivataan typen alla, suspendoidaan uudelleen 100 µl:aan metanolia, jäädytetään -80 °C:ssa -5 min, sentrifugoidaan lyhyesti ja injektoidaan HPLC-järjestelmään 1 kvantifiointia ja puhdistusta varten. Järjestelmä 1 on Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) -kolonni, jossa on 92:8 asetonitriili:vesi nopeudella 1,0 ml/min. Retinolifraktio kerättiin, kuivattiin typen alla ja suspendoitiin uudelleen 100 µl:aan metanolia injektiota varten järjestelmään 2. Järjestelmä 2 on identtinen kolonni, jossa oli 100 % metanolia nopeudella 0,7 ml/min. Retinolifraktio kerätään, kuivataan tyhjiössä SPD1010 SpeedVac -laitteella, suspendoidaan uudelleen 4-6 µl:aan heksaania ja injektoidaan 1-3 µl (noin 75 ng:n injektoimiseksi) GC:hen. GC/C/IRMS-järjestelmä julkaistiin (Howe et al., 2009). Atomi-% (At%) lasketaan suoraan (Isodat-versio 2.0) hiilidioksidin perusteella, joka on kalibroitu sakkaroosistandardia (NIST, 8542) vastaan.

Retinyyliesteri- ja karotenoidianalyysi: Seerumin karotenoidit ja retinyyliesterit analysoidaan julkaisun mukaisesti (Williams et al., 2021) Wisconsin-Madisonin yliopiston ravitsemustieteen laitoksen laboratoriossa ultra-performance-nestekromatografialla (Waters UPLC®) a. aiemmin kuvattu liuotinjärjestelmä (Gannon et al., 2018), optimoitu pienille näytemäärille ja halutut analyytit. Lyhyesti sanottuna 150 μl seerumia tai kaikki saatavilla oleva erit jaetaan borosilikaattilasiputkiin (Fisher Scientific), joihin lisätään 100 μl C-23 β-apo-karotenolia (sisäinen standardi optinen tiheys metanolissa ~1,0 aallonpituudella 325 nm) ja 225 μl etanolia lisätty. Orgaaniset yhdisteet uutetaan kolme kertaa 500 µl:lla heksaaneja, sekoitetaan pyörteellä ja sentrifugoidaan 1200 painoyksikön suhteellisella keskipakovoimalla 5 minuutin ajan. Yhdistetyt heksaanikerrokset kuivataan kartiopohjaisissa lasiputkissa typpivirrassa. Kuivattu uute suspendoidaan uudelleen 75 µl:aan metanoli:dikloorietaani-konsentraatiota suhteessa 75:25, siirretään UPLC-pulloihin (Waters) ja 6 µl injektoidaan UPLC-järjestelmään.

III.9. Orgaaninen synteesi projektin loppuun saattamiseksi. 13C-retinyyliasetaatin synteesi tavoitteiden 1 ja 2 toteuttamiseksi. 13C2-retinyyliasetaatti syntetisoidaan käyttämällä menetelmää, jonka on julkaissut yksityiskohtaisesti Tanumihardjo (2001). Lyhyesti sanottuna C18-tetraeeniketoni syntetisoidaan β-iononista, kaupallisesti saatavasta prekursorista, ja puhdistetaan huolellisesti. Käyttämällä modifioitua Whittig-Horner-menetelmää C-18-tetraeeniketoni saatetaan reagoimaan 13C2-leimatun trietyylifosfonoasetaatin karbanionin kanssa 2-13C:n lisäämiseksi retinoliosan runkoon. Saatu etyyliesteri pelkistetään alkoholiksi ja esteröidään 13C2-retinyyliasetaatiksi etikkahappoanhydridillä. Synteettinen all-trans-isomeeri puhdistetaan huolellisesti 8-prosenttisella vedellä deaktivoidulla alumiinioksidilla käyttämällä suhteellisen vaarattomia, erittäin haihtuvia, orgaanisia liuottimia, esim. heksaaneja ja dietyylieetteriä. Saatu valmiste karakterisoidaan käyttämällä UV-VIS-spektroskopiaa, TLC:tä ja HPLC:tä. Pitkäaikaista varastointia varten 14,15-13C2-retinyyliasetaattia säilytetään liuotettuna soijaöljyyn -80 oC:ssa. Valmistamme lopulliset annokset soijaöljyyn (~200 µl/annos) vähän ennen tutkimusta ja kuljetamme ne käsin jokaiseen tutkimuspaikkaan.

3,4-didehydroretinyyliasetaatin synteesi tavoitteen 4 toteuttamiseksi: Tohtori Tanumihardjo syntetisoi rutiininomaisesti 3,4-didehydroretinyyliasetaattia Atlantan, Georgian tautientorjuntakeskuksia varten käytettäväksi väestöpohjaisissa ravitsemusarvioinnissa. Siksi emme näe ongelmaa käyttää nykyisiä pyöriviä varastoja, jotka ovat varastossa -80 oC:ssa ehdotetussa A-vitamiinin tilan arvioinnissa kineettiseen tutkimukseen osallistuneiden äitien imeväisille. Yksinomaan Tanumihardjon laboratoriossa käytetyt synteettiset menetelmät on julkaistu (Barua ja Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Lyhyesti sanottuna retinoiinihappo metyloidaan diatsometaanilla. Saatu metyyliretinoaatti hapetetaan mangaanidioksidilla, jolloin muodostuu 4=oksometyyliretinoaatti. Huolellisen puhdistuksen ja kiteyttämisen jälkeen 4=okso pelkistetään 4-OH-metyyliretinoaatiksi käyttämällä natriumboorihydridiä. Kun on kiteytetty heksaaneissa -30 °C:ssa useita päiviä, 4-OH dehydratoidaan p-tolueenisulfonihapolla ja saatu 3,4-didehydrometyyliretinoaatti puhdistetaan ja sen annetaan kiteytyä yön yli. Lopuksi 3,4-didehydrometyyliretinoaatti pelkistetään 3,4-didehydroretinoliksi litiumalumiinihydridillä ja asetyloidaan välittömästi 3,4-didehydroretinyyliasetaatiksi, puhdistetaan, liuotetaan soijaöljyyn ja säilytetään -80 oC:ssa, kunnes annokset valmistetaan ja räätälöidään. yksittäisiä opintoja varten.

III.6. Eettinen selvitys Protokollat ​​ja tietoon perustuvat suostumuslomakkeet käyvät läpi eettisen tarkastelun IRSS:n institutionaalisissa arviointilautakunnissa, ja ne rekisteröidään Pan African Clinical Trial Registryssä (www.pactr.org). tietokanta yksilöllisen tunnistenumeron alla. Meillä on jo kokemusta lasten RID-testin kanssa työskentelystä (Bationo et al., 2019).

IV. Opintojen työsuunnitelma Aikasuunnitelma, IRSS Burkina Faso Aktiviteetit Vuosi 1 Vuosi 2 Vuosi 3 Vuosi 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Protokollan viimeistely Eettinen tarkastelu ja hyväksyntä SOP-kehitys Opintopaikan valmistelu Opintohenkilökunnan valinta ja koulutus Ensimmäisen poikkileikkaustutkimuksen ensimmäinen kierros Näytteiden valmistelu ja varastointi Ensimmäisen kierros poikkileikkaustutkimus Näytteiden valmistelu ja varastointi Näytteiden toimitus Toisen poikkileikkaustutkimuksen ensimmäinen kierros Näytteiden valmistelu ja varastointi Toisen poikkileikkaustutkimuksen toinen kierros Näytteiden valmistelu ja varastointi Näytteiden siirto Laboratorioanalysoitu Tiedonkäsittely Levittäminen, paikallinen, kansallinen, kansainvälinen