Валидация и упрощение метода разведения изотопа ретинола у школьников Буркина-Фасо (RID_VAB)

Название проекта Валидация и упрощение метода разведения изотопа ретинола у школьников Буркина-Фасо

I. Предыстория и рациональность. Биомаркеры статуса витамина А, которые отражают золотой стандарт, то есть биопсию печени, доступны, но проходят доработку для повышения доступности для популяционных приложений. Тест на изотопное разбавление ретинола (RID) является одним из таких биомаркеров. В Буркина-Фасо нам удалось оценить 7-дневный тест с 14-дневным тестом с простым добавлением поправочного коэффициента в уравнение прогнозирования. Значения общих запасов витамина А в организме были схожими, но различия увеличивались по мере увеличения резервов печени. Предположение о том, что у детей школьного возраста 3% массы тела приходится на массу печени, было подтверждено как приемлемое при расчете общих запасов витамина А в печени. Упрощение изотопного разбавления для оценки населения и наращивание потенциала для масс-спектрометрического анализа являются важными областями развития питания для информирования программ общественного здравоохранения. Это предложение будет продолжать совершенствовать метод для его широкого использования.

II. Общая цель Предоставить новые знания о том, как использовать метод разведения изотопа ретинола в более крупных опросах населения для оценки статуса витамина А от дефицита до избытка.

II.1. Конкретные цели Для данного ПКИ было обозначено несколько конкретных целей. Посредством исследования, которое будет проводиться в Буркина-Фасо, и на основе существующих наборов данных, мы сосредоточимся на следующих конкретных целях школьников.

1. Определить величину избыточного общего резерва печени по витамину А, применяя данные ретинилового эфира сыворотки натощак у школьников с помощью RID-теста. 2. Изучить, как существующую методологию можно упростить, чтобы она соответствовала опросам населения без потери точности, используя методы очистки ретинола на месте. 3. Изучить, как метод разведения изотопа ретинола влияет на воспаление во время введения дозы, используя существующий набор данных у африканских детей дошкольного возраста. 4. Изучить разницу в абсорбции изотопа ретинола. 3,4-дидегидроретинилацетат из масла и в капсулированной форме у детей школьного возраста.

III. Метод III.1. Место проведения исследования и население Предлагаемое исследование будет проводиться в начальной школе в западной части Буркина-Фасо, в Ородаре, деревне на внешней окраине Бобо-Диуласо, где мы будем ориентироваться на детей в возрасте от 7 до 12 лет. Большинство жителей села — фермеры со средним доходом и члены их семей. Буркина-Фасо является одной из стран, участвующих в консорциуме VITAAFRO (Витамин А в Африке), который заинтересован в точном определении статуса VA для информирования о существующих вмешательствах и политике.

III.2. План исследования В течение учебного года будут проведены два последовательных перекрестных исследования. Первое исследование в начале учебного года, то есть в конце сезона дождей и вне сезона манго, и второе исследование, проведенное через 5–6 месяцев после первого набора данных, во время сезона манго эти исследования будут проводиться в начальной школе в западной части Буркина-Фасо, в Ородаре, деревне на внешней окраине Бобо-Диуласо.

III.3. Метод выборки Всего 158 школьников будут набраны двумя разными способами. Сначала группа из 60 школьников будет набрана путем стратифицированной выборки, включающей детей с первого по последний год начальной школы и пропорционально их количеству в классе. К этой первой группе из 60 школьников будет применен тест на разведение изотопов ретинола (RID) для оценки общих запасов в организме для сравнения значений с концентрацией ретинилового эфира в сыворотке натощак на исходном уровне.

Остальные 98 школьников будут набраны по стратифицированной выборке и пропорционально их количеству в классе и разделены на две группы по 49 детей в зависимости от пола (т.е. 49 женщин и 49 мужчин). У каждого участника будет проведено два забора крови. Затем участник будет случайным образом назначен для взятия проб крови в точках H0, H2, H3, H4, H5, H6, H8, H10, H24, H72, H168 и H336, как указано ниже. Список рандомизации будет сгенерирован с использованием таблиц случайных чисел. Мы решили использовать блокировку, а не простую рандомизацию, потому что первый подход позволит нам иметь беспристрастные группы сравнения, которые будут примерно одинакового размера на протяжении всего исследования. При использовании блочной рандомизации в каждой исследовательской группе всегда будет почти одинаковое количество детей.

Для этих групп детей будет использоваться модифицированный тест относительной реакции на дозу (MRDR), качественная мера статуса витамина А для исследования абсорбции 3,4-дидегидроретинилацетата.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), Х336 (10)

III.4. Информированность и повышение осведомленности сообщества Перед началом исследования мы проведем серию встреч с ключевыми лицами, принимающими решения, и лидерами сообщества в исследуемой зоне в рамках усилий по повышению осведомленности и мобилизации сообщества для исследования. Эти встречи с общественностью и повышение осведомленности будут информировать сообщество о существовании и цели исследования, а также о пользе не только для их сообществ, но также для страны и Африки в целом. Им будут объяснены причины выбора места для каждого исследования на людях и предлагаемый дизайн.

III.5. Набор и проверка

В ходе отбора будет составлен список подходящих школьников, из которого будет произведен отбор. Дети будут иметь право на участие, если они соответствуют следующим критериям отбора:

III.5.1. Критерии включения:

• Школьники в возрасте 7-12 лет
• Опекун или родитель ребенка готов предоставить информированное согласие
• Семья ребенка планирует остаться проживать в исследуемых районах в течение периода обучения.

III.5.2. Критерии исключения:

• Клинические признаки дефицита витамина А в неправильной форме : English (Royaume-Unis)в неправильной форме : English (États-Unis)не в форме : English (États-Unis)не в форме : English (États-Unis)
• Тяжелая степень недостаточности питания (Z-показатель веса к возрасту (WAZ) или Z-показатель роста к возрасту (HAZ) <-3 SD)
• Серьезные заболевания, включая туберкулез, симптоматическую ВИЧ-инфекцию.
• Ребенок в возрасте <6 лет или >12 лет III.6. Переменные исследования. После проверки на соответствие требованиям от ребенка и его опекуна или родителя будет получено информированное согласие. Мы будем собирать социально-экономическую информацию (например, доход, образование, семейное имущество) и провести антропометрические измерения (вес, рост), оценку состояния гемоглобина, а также приготовить толстые и тонкие мазки крови для выявления малярии. Будет собран образец кала для определения кишечных паразитов.

III.7. Обработка образцов крови Для 60 детей, участвующих в общем анализе запасов тела, мы будем ориентироваться на детей в возрасте от 7 до 12 лет, и будут получены исходные характеристики субъектов. Первоначально у каждого ребенка натощак будет взят образец венозной крови (7 мл). После этого им будет введена пероральная доза 1,0 мкмоль [14,15]-13C2-ретинилацетата, который будет синтезирован, как опубликовано (Tanumihardjo, 2001), растворен в соевом масле и введен с помощью пипетки с положительным вытеснением объемом 250 мкл. За дозой сразу последует одна чайная ложка оливкового масла для облегчения абсорбции. Дети будут есть стандартный завтрак из белого хлеба и ореховой пасты со вкусом шоколада. Кровь для последующего наблюдения будет собрана медсестрами клиники Ородара на 14-й день после введения дозы, немедленно сохранена на льду и отправлена ​​в Научно-исследовательский институт наук де ла Санте, расположенный в Бобо-Диуласо, для обработки.

Образцы сыворотки той же группы из 60 школьников будут разделены на аликвоты в три пробирки и заморожены при -80 градусах Цельсия.

Все образцы будут отправлены или доставлены вручную в Университет Висконсин-Мэдисон (UW) для анализа методом газовой хроматографии-сгорания-масс-спектрометрии соотношения изотопов (GCCIRMS), как описано ниже.

Исходные образцы крови также будут проанализированы на наличие сывороточных ретиниловых эфиров и каротиноидов, как описано ниже для небольших объемов образцов.

Подобный метод использовался в Буркина-Фасо в прошлом (Bationo et al., 2018), который выявил низкое потребление овощей. Однако после того, как было проведено это исследование, масло, обогащенное витамином А, теперь стало широко доступно в стране. Это исследование повысит ценность валидации эфиров ретинила в сыворотке крови как показателя избытка витамина А.

Предварительная очистка ретинола из сыворотки будет исследована с использованием методов твердофазной экстракции (ТФЭ) с консервантом из одной аликвоты, чтобы избежать дополнительной нормативной нагрузки, связанной с доставкой биологических образцов человека (сыворотки). Сначала мы определим оптимальные протоколы в Университете Висконсина в Мэдисоне. Пилотные исследования показали, что ТФЭ прямой фазы с использованием колонок NH2 и растворителей гексан/этилацетат обеспечивает очень высокую степень извлечения и чистоты ретинола из сыворотки, и мы будем исследовать бутилированный гидрокситолуол и альфа-токоферол в качестве консервантов. Если в полевых условиях используется предварительная очистка ТФЭ, мы планируем провести повторную очистку ретинола с помощью ВЭЖХ перед введением в GCCIRMS, чтобы определить, какой консервант не будет мешать повторной очистке и анализу ВЭЖХ.

Существующий набор данных по африканским детям дошкольного возраста в возрасте от 3 до 4 лет для изучения того, как на технику RID влияет воспаление во время введения дозы. Хорошо известно, что уровень ретинола в сыворотке крови и ретинол-связывающего белка временно снижается при воспалении (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Это может повлиять на оценку статуса витамина А в группах населения с высоким уровнем клинических или субклинических инфекций (Suri et al., 2015; 2021). Однако потенциальное влияние воспаления на РИД не оценивалось у большой группы детей. Мы рассчитали общие запасы витамина А в организме у детей из Буркина-Фасо, Эфиопии, Камеруна, Южной Африки и Танзании. Статус воспаления оценивали путем измерения С-реактивного белка (СРБ) и альфа1-кислотного гликопротеина (АГП), полученных из образцов крови во время введения дозы. Мы рассмотрим связь между общими резервами печени (TLR) на основе теста 13C-RID и непрерывными значениями СРБ и АГП, проверяя, не равен ли наклон зависимости нулю. Мы также сравним категориальные средние значения TLR, используя следующие четыре категории воспаления: отсутствие воспаления, инкубация (только повышенный уровень СРБ (> 5 мг/л)), раннее выздоровление (повышенный уровень СРБ и АГП (> 1 г/л)) и позднее выздоровление (только повышенный уровень АГП) с использованием теста ANOVA для определения различий между группами.

Для второго перекрестного исследования, включающего тест MRDR, мы по-прежнему будем ориентироваться на детей в возрасте от 7 до 12 лет, и будут получены исходные характеристики субъектов для оценки кривых абсорбции с использованием аналога и определения наличия разницы в кривых абсорбции при использовании капсул.

В этом исследовании будет изучена абсорбция 3,4-дидегидроретинилацетата по аналогии с меченым ретинилацетатом в капсулах по сравнению с прямыми пероральными дозами в масле. Используя те же процедуры информирования и повышения чувствительности, как указано выше, дети будут разделены на шесть групп по 15 человек и случайным образом распределены на прием капсул или прямую пероральную дозу с разным моментом взятия проб крови, от 0 до 7 часов спустя. Все образцы будут проанализированы на наличие 3,4-дидегидроретинола и 3,4-дидегидроретиниловых эфиров. Спиртовая форма будет соответствовать той, которая связана с ретинол-связывающим белком (RBP), а сложные эфиры будут отражать кривые абсорбции.

Все дети получат 7,0 мкмоль 3,4-дидегидроретинилацетата, растворенного примерно в 200 мкл соевого масла. Пороговый уровень дефицита витамина А для теста MRDR составляет 0,060, что соответствует соотношению 3,4-дидегидроретинола и ретинола через 4–6 часов после приема дозы. Поэтому эта мерка будет у каждого ребенка. Область под кривой абсорбции эфира от 2 до 5 часов покажет распределение хиломикронов при пероральной дозе. Все образцы будут проанализированы с использованием стандартного метода 250 мкл для MRDR и расширенного метода UPLC для 3,4-дидегидроретинола и 3,4-дидегидроретиниловых эфиров.

Исследование будет состоять из двух этапов:

Начальный этап исследования будет проводиться после сезона манго (ноябрь-декабрь), а второй этап исследования будет проводиться во время сезона манго (апрель-май).

III.8. Лабораторный анализ

Анализ проб методом газовой хроматографии-сгорания-масс-спектрометрии соотношения изотопов (GCCIRMS):

Сыворотка: ранее сообщалось о процедурах выделения сыворотки и инструментах для анализа GCCIRMS (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Вкратце, сыворотку оттаивали при комнатной температуре. К 0,75 мл (или всей имеющейся) сыворотки добавляют этанол (1 объем) для осаждения белков, добавляют бета-апокаротенол C23 в качестве внутреннего стандарта и проводят 3 экстракции гексаном по 1 мл. Гексаны объединяют, сушат в атмосфере азота, ресуспендируют в 100 мкл метанола, замораживают при -80⁰C в течение ~5 минут, кратковременно центрифугируют и вводят в систему ВЭЖХ 1 для количественного определения и очистки. Система 1 представляет собой колонку Gracesmart C18 (5 мкм, 4,6×250 мм) с соотношением ацетонитрил:вода 92:8 при скорости 1,0 мл/мин. Фракцию ретинола собирали, сушили под азотом и ресуспендировали в 100 мкл метанола для введения в систему 2. Система 2 представляет собой идентичную колонку со 100% метанолом при скорости 0,7 мл/мин. Фракцию ретинола собирают, сушат в вакууме с помощью SPD1010 SpeedVac, ресуспендируют в 4-6 мкл гексана и вводят 1-3 мкл (чтобы ввести примерно 75 нг) в ГХ. Опубликована система GC/C/IRMS (Howe et al., 2009). Атомный % (At%) рассчитывается напрямую (версия Isodat 2.0) относительно диоксида углерода, который калибруется по стандарту сахарозы (NIST, 8542).

Анализ эфиров ретинила и каротиноидов. Каротиноиды и эфиры ретинила будут анализироваться в соответствии с опубликованными данными (Williams et al., 2021) в лаборатории факультета диетологии Университета Висконсин-Мэдисон с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии (Waters UPLC®) в соответствии с описанная ранее система растворителей (Gannon et al., 2018), оптимизированная для небольших объемов проб и желаемых аналитов. Вкратце, 150 мкл сыворотки или все доступные аликвоты разливают в пробирки из боросиликатного стекла (Fisher Scientific), в которые помещают 100 мкл C-23 β-апокаротинола (внутренний стандарт оптической плотности в метаноле ~1,0 при 325 нм) и 225 мкл этанола. добавлен. Органические соединения трижды экстрагируют по 500 мкл гексана, перемешивают на вортексе и центрифугируют при относительной центробежной силе 1200 ед. тяжести в течение 5 мин. Объединенные слои гексана сушат в стеклянных трубках с коническим дном в токе азота. Высушенный экстракт ресуспендируют в 75 мкл смеси метанол:дихлорэтан в соотношении 75:25, переносят во флаконы для UPLC (Waters) и 6 мкл впрыскивают в систему UPLC.

III.9. Органический синтез для завершения проекта. Синтез 13C-ретинилацетата для выполнения задач 1 и 2. 13C2-ретинилацетат будет синтезирован с использованием процедуры, подробно опубликованной Танумихарджо (2001). Вкратце, C18-тетраенкетон синтезируют из β-ионона, коммерчески доступного предшественника, и тщательно очищают. Используя модифицированную процедуру Уиттига-Хорнера, тетраенкетон C-18 подвергается взаимодействию с карбанионом 13C2-меченного триэтилфоспоноацетата с добавлением 2-13C к основной цепи ретинольного фрагмента. Полученный этиловый эфир восстанавливают до спирта и этерифицируют до 13С2-ретинилацетата уксусным ангидридом. Синтетический полностью транс-изомер тщательно очищают на 8%-ной дезактивированной водой оксиде алюминия с использованием относительно безвредных, легколетучих органических растворителей, например, гексанов и диэтилового эфира. Полученный препарат характеризуют с помощью УФ-ВИД-спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ. При длительном хранении 14,15-13С2-ретинилацетат хранят растворенным в соевом масле при температуре -80°С. Мы приготовим окончательные дозы в соевом масле (~ 200 мкл/доза) незадолго до исследования и принесем их вручную в каждый участок исследования.

Синтез 3,4-дидегидроретинилацетата для выполнения задачи 4: Доктор Танумихарджо регулярно синтезирует 3,4-дидегидроретинилацетат для Центров по контролю заболеваний в Атланте, штат Джорджия, для использования в популяционных оценках питания. Таким образом, мы не предвидим проблем с использованием текущих ротационных запасов, хранящихся при температуре -80°C, для предлагаемой оценки статуса витамина А у младенцев от матерей, участвовавших в кинетическом исследовании. Методики синтеза, используемые исключительно в лаборатории Танумихарджо, опубликованы (Баруа и Гош, 1972; Танумихарджо, Баруа, Олсон, 1987). Вкратце, ретиноевая кислота метилируется диазометаном. Полученный метилретиноат окисляют диоксидом марганца с образованием 4=оксометилретиноата. После тщательной очистки и кристаллизации 4=оксо восстанавливают до 4-ОН-метилретиноата с использованием боргидрида натрия. После кристаллизации в гексане при -30°С в течение нескольких дней 4-ОН дегидратируют п-толуолсульфоновой кислотой и полученный 3,4-дидегидрометилретиноат очищают и оставляют кристаллизоваться на ночь. Наконец, 3,4-дидегидрометилретиноат восстанавливают до 3,4-дидегидроретинола алюмогидридом лития и немедленно ацетилируют до 3,4-дидегидроретинилацетата, очищают, растворяют в соевом масле и хранят при -80°C до тех пор, пока не будут приготовлены и адаптированы дозы. для индивидуальных занятий.

III.6. Этическое одобрение Протоколы и формы информированного согласия пройдут этическую проверку в институциональных наблюдательных советах IRSS и будут зарегистрированы в Панафриканском реестре клинических исследований (www.pactr.org). базу данных под уникальным идентификационным номером. У нас уже есть опыт работы с тестом RID у детей (Bationo et al., 2019).

IV. Рабочий план исследования План времени, IRSS Буркина-Фасо Мероприятия Год 1 Год 2 Год 3 Год 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Завершение протокола Этическая экспертиза и утверждение Разработка СОП Подготовка места проведения исследования Отбор и обучение персонала для исследования Первый раунд первого поперечного исследования Подготовка и хранение проб Второй раунд первого поперечного исследования Подготовка и хранение проб Отгрузка проб Первый раунд второе перекрестное исследование Подготовка и хранение проб Второй раунд второго перекрестного исследования Подготовка и хранение проб Отгрузка проб Лабораторный анализ Обработка данных Распространение, местное, национальное, международное